实时定量PCR技术及其应用.ppt

实时定量PCR技术及其应用 Four Channel Multiplexing Data Data shows four channel TaqMan data. GAPDH run across six orders of magnitude With FAM, JOE, ROX and CY5. Acquired data for each channel can be viewed simultaneously during run. 4通道同时数据采集的界面 样品数据均一化 阈值选定 Ct值计算 定量数据规格 * 实时定量PCR技术及其应用 荧光定量 PCR 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标 记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。 荧光定量 PCR仪 光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，通常配有电脑系统及相应的分析软件。 荧光定量实时PCR与普通PCR的比较 实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性 增加定量的精确性 全程监控，准确的算法进行定量 结果分析更加快捷方便，无需跑胶 荧光标记 荧光定量PCR标记方法 内掺式染料 SYBR Green I 序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) 引物特异性探针 Amplifluor (Intergen) 5’ 3’ 5’ 3’ SG Excitation SG SG SG SG Emission SYBR-Green I 5’ 3’ 5’ 3’ SG SG SG SG SG Excitation Emission SYBR-Green I R Q 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Excitation R Q Q R Q R Excitation 双标记探针（Taqman Probe） R Q Excitation R Q Q R Excitation Emission 分子信标（Molecular Beacon Probe） Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: LC Red 640 Excitation Emission Transfer 荧光共振能量传递（FRET Probe） 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ R Q 5’ R Q R Q 3’ 5’ Q R R R Emission Excitation Q R 引物特异性探针（Amplifluor Probe） 探针设计的一般原则： 扩增片段的长度不应太大,一般小于300bp 探针不能和任一引物互补 探针保证特异性的前提下尽可能的短，长度不超过30bp 探针的Tm值至少比引物的Tm值高5度 探针应尽可能的靠近引物 如用于检测多态位点,多态位点应尽可能的靠近探针中部 探针5’端不能是G，G有淬灭作用 Rotor-Gene 全新4通道实时荧光定量PCR仪 Rotor-Gene简介 独特的离心式热循环仪，反应时样品以每分钟500转旋转，保证了极高的温度均一性 4个独立的激发光源，6个滤光片的检测体系，满足多种荧光染料，多通道同时检测的需要,无光谱重叠误差 LED光源，PMT检测器,精确的定量结果 极高的灵敏度，宽达12个数量级的线性范围 软件操作简单，功能强大。供多种分析功能 开放的试剂系统，目前所有荧光标记的方法都可使用 低廉的运行成本 与自动加样机器人联用 光学结构 激发波长 Ch1: 470nm Ch2: 530nm Ch3: 585nm Ch4: 625nm 500rpm Stepper motor 36/72 well Rotor 4-通道激发光源 LED（激光二极管）激发光源从反应舱边缘激发样品 PMT（光电倍增管）与LED成垂直位置检测发射荧光信号，避免激发光源的干扰 荧光能量通过薄壁管传递 6种滤光片供选用 固定的检测激发光路, 避免了样品内和样品间光谱交叉产生的误差 检测器和滤光片 热力学结构 升降温方式 位于顶部的环形镍-铬金属加热元件加热封闭的样品反应舱中的空气 在降温时，位于底部的强力排风扇将反应舱内热空气排出，同时打开顶部排气孔，吸入外部的空气 样品在反应时保持 500rpm的转速，超凡的温度均一性 在频繁的升降温过程中由于无须制冷，整机可靠性提高、故障少 Real-time Chemist