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实时定量PCR SPEAKER:吴梓栋 CONTENTS 1.实时定量PCR是弄啥累？ 2.论实时定量PCR的工作原理 3.详解怎样定量 4.优势劣势 又称qPCR qPCR简介 所谓实时定量PCR技术?，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 qPCR原理简介 qPCR原理 实时定量PCR的发明归功于2个重要的发现:一是发现DNA Taq酶有5’→3’外切酶活性;二是利用荧光能量传递技术构建了双标记寡核苷酸探针即TaqMan探针。 TaqMan探针:这种探针能被DNA合成酶(例如Taq酶)的5’→3’活性所降解,探针的5’端有一荧光报告基团, 3’端有一荧光淬灭基团,当2个基团相互先靠近的时候,由于发生能量传递作用,报告基团不能发出荧光,但随着扩增反应的进行,5’端的报告基团随着探针的水解而脱落下来,不再发生能量传递作用,从而能发出荧光,被信号探测器所捕获。 将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，变性、复性、延伸的热循环，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。 什么？ 你问我什么是Ct值？ 这可是关乎到怎样定量的问题呢 好吧，一起来看看Ct值是什么鬼 Ct值（Cycle threshold，循环阈值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的默认设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 Ct值与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，模板DNA量越多，荧光达阈值的循环数越少，即Ct值越小。利用用一系列已知浓度的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 优势劣势 优 劣 THANK YOU！ SPEAKER:吴梓栋 * *
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