沉淀法生物工程下游技术.pptVIP

* MgSO4用以去除DNA和其他核酸； CaCO3用于分离乳酸，血清蛋白和柠檬酸 * * * * * * * * * 如苯丙氨酸被认为是最疏水的，而精氨酸则是最亲水的。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。 * * 蛋白质的水溶液呈胶体性质。蛋白质的溶解度也取决于水的可利用度。 ⑴蛋白质周围的水化层（hydration shell)，保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞，使蛋白质形成稳定的胶体溶液。 ⑵蛋白质分子间静电排斥作用。偏离等电点的蛋白质净电荷或正或负，成为带电粒子，在电解质溶液中吸引相反电荷 的离子（简称反离子），形成扩散双电层，当双电层的δ电位足够大时静电斥力抵御分子间的相互吸引作用（分子间 力），使蛋白质溶液处于稳定状态。 * 盐析是可逆的，而变性是不可逆的. 水溶液中蛋白质的溶解度一般在生理离子强度范围内最大，而低于或高于此范围时溶解度均降低。 * （1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集， 将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。 （2）破坏水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，疏水区域越多，越易沉淀。 （3）中和电荷，减少静电斥力， 中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。 * * β—与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关； Ks—盐析常数，一些实验结果表明，Ks与温度和pH无关，但和蛋白质与盐的种类有关。 盐析常数Ks大时，蛋白质溶解度受盐浓度的影响大，盐析效果好。 据此，盐析法可分为两类， 第一类叫Ks分段盐析法，在一定pH和温度下通过改变离子强度实现，由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，用于早期的粗提液； 第二种叫β分段盐析法，在一定离子强度下通过改变pH和温度来实现，由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，用于后期进一步分离纯化和结晶。 * 第一种方法：加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高； 第二种方法：它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。 * 盐析作用要强，一般来说多价阴离子的盐析作用强。 需有较大的溶解度，且溶解度受温度影响应尽可能地小。 盐溶液密度不高，以便蛋白质沉淀的离心分离。 盐析用盐必须是惰性的，不致影响蛋白质的活性。 * 在相同的离子强度下，离子的种类对蛋白质的溶解度有一定程度影响。 * * * * * * * 一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解度最小。 例如与负离子结合的蛋白质，其等电点常向酸侧移动，当蛋白质分子结合较多的Mg2+、Zn2+等阳离子时等电点则向高pH偏移。 * * 在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。 β随温度升高减小，热促失水膜 Ks不随温度而变 如胃蛋白酶、大豆球蛋白，它们在高盐浓度下的溶解度随温度上升而增高，而卵球蛋白的溶解度几乎不受温度影响，卵清蛋白在25度时溶解度最小 * * * * 有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。 * * A 降低溶剂介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了蛋白质等带电粒子之间的作用力，因而相互吸引而聚合沉淀。 B 破坏水化膜：由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏水化层，降低蛋白质分子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白质沉淀。 C 疏水作用：疏水基团暴露并与有机溶剂疏水基团结合形成疏水层 * * 乙醇：沉淀作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析； 丙酮：沉淀作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广； * 有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量。 而且在形成沉淀后温度也要控制，温度升高，沉淀可能重新溶解，如果温度下降，可能使沉淀增多（其中包括杂蛋白），在有些情况下，把沉淀后的清液温度再降低，可沉淀出另一个产品，这就是所谓的温度分级沉淀。为了减少溶剂对蛋白质的变性作用，通常使沉淀在低温下作短时间的老化处理（0.5～2h），即分离，接着抽去剩余溶剂或将沉淀溶入大量缓冲液以稀释溶剂。 * 5、某些金属离子：一些金属离子如Ca2+、Zn2+等可与某些呈阴离子状态的蛋白质形成复合物，这种复合物溶解度大大降低而不影响生物活性，有利于沉淀形成，并降低溶剂用量。 * * * 剩余的金属离子用H2S去除，剩余的有机酸和磷钨酸用无机酸并用乙醚萃取。 有机溶剂沉淀法机理 有机溶剂沉淀法原理