目的基因的克隆及基因文库的构建1.pptVIP

A 鸟枪法 B cDNA法 C PCR法 基因文库的构建 基因文库的构建程序 从基因文库中筛选目的基因 大型基因组文库一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除 了一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白 编码基因等）可以采用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选法、 酵母双杂交技术等）直接筛选外，一般的基因组文库筛选均需多轮 操作步骤 基因文库的构建程序 从基因文库中筛选目的基因 密集铺板（1-10万） 杂交 挖取 铺板 铺板 目的重组克隆 基因文库的构建程序 基因文库构建的技术性问题 在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是： 严禁外源DNA片段之间的连接！！！ 为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合： 将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离 用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团 用TdT酶在DNA片段的末端上增补同聚尾末端 基因组文库重组克隆的排序 大型基因文库（包括人的基因文库）的构建在技术上并不十分困难，如果一个YAC基因文库的插入片段总和为整个基因组的十倍以上时，一般就能从基因文库中调出任何一段DNA序列。然而基因文库的克隆都是随机序列，必须将所有的克隆排列成一个像天然染色体DNA上所表现出的信息顺序。这项工作的工作量可能远大于基因组文库的构建，属于基因文库的后期制作 基因组文库重组克隆的排序 将单一的YAC克隆插入DNA片段用限制性内切酶分布均匀地水解成若干片段，末端标记同位素 然后再用Sau3AI或MboI将末端标记的DNA片段降解成碎片，聚丙烯酰胺凝胶电泳，每10个YAC克隆走在同一块板上，形成10个克隆的特征性DNA指纹图谱 电脑分析指纹图谱，如发现任何两个克隆DNA的指纹图谱有部分相同的，则其两个YAC片段就有互相重叠的可能性，于是这两个YAC克隆的DNA片段克隆在染色体上是排列一起的 酶切片段末端标记法 酶切片段末端标记法 H H H H S S S S S S S S S S S S S S S S S S S 单一克隆指纹图谱 十克隆指纹图谱 载体DNA 克隆DNA 基因组文库重组克隆的排序 将若干YAC克隆固定在薄膜上，并复制二十份薄膜；合成20种不同序列的短探针，其序列是随机的 用20种探针随机定位杂交（一对一）20份YAC克隆薄膜 如果某两个克隆同时对同一种探针呈现杂交阳性反应，则这两个克隆有可能是相互重叠的。若将杂交阳性结果记为“1”，而阴性结果记为“0”，可清晰地列成一张表，最终排出上述YAC克隆的排列顺序 随机探针联合杂交法 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 A B C D E F G 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 D A B C E F G 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 目的基因的克隆与基因文库的构建 C PCR法 B cDNA法 A 鸟枪法 D 基因文库的构建 基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。 一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 鸟枪法操作的改进 鸟枪法克隆目的基因的局限性 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 染色体DNA的切断 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开， 大小不可控 部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整 与载体连接 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载 体；