2016级细胞模型实验报告.docVIP

PAGE 10 广西医科大学 实 验 报 告 科目： 细胞模型实验 年级： 研究生院2016级 组别： A组 学号： ************* 姓名： ******** 实验二 MTT法测定药物对细胞生长的抑制作用 实验原理：? ＭＴＴ比色法原理是活细胞内的琥珀酸脱氢酶能将淡黄色的ＭＴＴ还原为蓝紫色的结晶甲臜。后者结晶产物的量与活细胞数目成正相关，而死细胞或红细胞没有此功能。结晶用ＤＭＳＯ、无水乙醇、酸化异丙醇等溶解，在酶标仪上以波长为490ｎｍ进行比色,所检测吸光值的大小可反应细胞代谢活性的强弱。? 实验步骤： 1：贴壁细胞消化和吹打?：加1ml0.5%胰蛋白酶并轻摇使其遍布所有细胞表面至镜下观察发现胞质回缩、间隙增大停止,倒掉,加入含小牛血清的培养液,反复吹打至瓶壁上无贴壁细胞为止。 2：计数与分板?：取20ul细胞悬液于计数板计数,用1640培养液调整使其细胞数约为5×104个/ml,在96孔培养板中加入细胞悬液每孔100ul,共18个,培养箱孵育12h。 3：加药与孵育于培养板中分别加入浓度为0.1,0.2,0.4,0.8,1.6mg/ml环磷酰胺注射液各100ul,每组重复3孔,设空白对照组3孔各100ul,孵育24小时。 4：MTT显色每孔加MTT20ul，3小时候弃上清，每孔加DMSO100ul。 5：酶标仪测定：490nm处测其吸光度? ? 实验结果及讨论:? 1.不同浓度药物的生长抑制率如下? 浓度（ug/ml） 平均吸光度（x±s） 抑制率（%） 存活率（%） 1600 -0.15367 -18.98% 118.98% 800 -0.01133 -1.40% 101.40% 400 0.254333 31.42% 68.58% 200 0.075667 9.35% 90.65% 100 0.121667 15.03% 84.97% 0 0.32 39.53% 60.47% 2.浓度与抑制率关系图 注：横坐标为浓度对数值、纵坐标为抑制率 3.?讨论：? 1.?本次实验出现错误较多，OD值出现负值和其中还有400ug/ml组加悬液过量，致使数据有所偏离。? 2.?加DMSO之后颜色对比明显，并且梯度效果比较好，平行孔间颜色较均匀，随浓度梯度变化相对明显，能够体现出抑制作用。????? 3.实验数据过少不能够完全判定药物的抑制作用，另因为如果孔内的细胞状态不好也有可能导致细胞死亡。 实验三?HE染色法观察药物作用细胞后的形态学变化? 实验原理：? HE染色法采用两种染料即碱性染料苏木素和酸性染料伊红分别与细胞核和细胞质发生作用，使细胞微细结构通过颜色而改变它的折射率,从而在光镜下能清晰显示出细胞图像,染色的结果是酸性的细胞核被碱性的苏木素染成蓝色，碱性的细胞质被酸性的伊红染成红色。? 实验步骤：? 样品制备:胰酶消化贴壁生长细胞,调整细胞浓度为1×105个/ml,每孔2ml加于6孔板,加盖玻片,加入药物培养相应时间,取出盖玻片,用PBS洗涤3次。 2.?样品固定:?95%乙醇固定20min后PBS清洗2次。? 3.?染细胞核:?苏木精染色5-10min后自来水水洗。? 4.?染细胞质:?伊红染色1-2min后自来水水洗。? 5.?脱水、透明:?70%，95%，100%乙醇逐级脱水,二甲苯透明,吹干。? 6.?封片:在载玻片上滴加甘油，将有细胞的一片的盖玻片向下封固于载玻片上。 ?实验结果及分析: 染色的结果是酸性的细胞核被碱性的苏木素染成蓝色，碱性的细胞质被酸性的伊红染成红色。如图所示染色的结果随药物浓度变化而变化，药物对细胞的抑制作用较为明显，并且体现出浓度趋势，整体的染色效果尚可。 实验四?吖啶橙荧光染色法观察细胞形态学的变化? 实验原理：? 吖啶橙是一种与DNA和RNA都能结合的荧光染料，在蓝色光或紫外光的激发下，DNA和RNA都会激发出荧光，活细胞经过固定，染色后细胞DNA成亮绿色，核仁和散布在细胞质中的RNA成橘红色，胞质的其余部分为淡红褐色。死亡的细胞，因为物质就够发生变化，其细胞核成暗绿色，细胞质也是成暗绿色。? 实验步骤：? 胰酶消化贴壁细胞,调整细胞浓度为1×105?/ml,?每孔2ml加于6孔板,?加盖玻片,加入药物培养相应时间,?取出盖玻片,用PBS洗涤3次,除去血清 95%乙醇固定15~30min 1%醋酸作用30s，1×10-4AO染色30s~60s，0.1M?CaCl2处理30s~2min PBS漂洗3次 甘油封片? 实验结果及分析： 对照组 IC50组 正常细胞染色后发出绿色荧光，密度不均匀呈结构样特征，而凋亡小体边