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细 胞 与 组 织 培 养 技 术 李 呼 伦 哈尔滨医科大学神经生物学教研室 2014.09.18 前 言 组织培养技术的应用 基础研究 工业化生产 3、人遗传疾病组织细胞通过iPS建立疾病过程 二、体 外 培 养 的 分 类 体外培养 in vitro 细胞培养 Cell culture 组织培养 Tissue culture 器官培养 Organ culture 细胞培养 （ Cell culture ） 培养物是单细胞或群体细胞 模拟体内生理环境，在无菌、适当的温度和一定的营养条件下，使之生长生存维持结构和功能的培养方法。 组织培养（Tissue culture） 方法同上，使用组织块(0.5-1mm3)或薄片(0.2mm) 器官培养（Organ culture） 应用和组织培养相似的条件，培养的是器官的原基、 器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长 和保持一定功能的方法 使用器官原基或器官的一部分或整个器宫 三、组织与细胞培养的优缺点 优点： 能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动；可用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科的研究工作 便于观察、记录、摄影，直接观察细胞变化 可供研究的细胞种类广泛，从低等生物到高等动物，以及人类；从胚胎到成体；从正常组织到肿瘤细胞皆可 便于使用不同方法研究细胞（相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、组织化学和同位素标记等） 培养细胞携带有与体内细胞同等的基因组，是分子生物学和基因工程学的研究对象和组成部分 可同时提供大量生物性状相似的实验对象，耗资少，经济 易于施加物理、化学和生物因素进行实验 已成为生物制品、基因工程制品、单克隆抗体生产的必要手段 局限性： 组织和细胞离体以后，独立生存在人工培养环境中，与体内环境相比，仍有很大差异。故实验结果不能推至体内，轻易做出与体内等同的结论 四、组织与细胞培养的细胞生物学特点 体内外细胞的差异：当人工条件和体内实际情况不完全相同时，细胞在体外培养后，一旦失去神经体液调节和细胞间相互影响，生活在缺乏动态平衡的环境中，发生变化则是必然。细胞最多见的表现是：返祖（Atavism）现象，即失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱、细胞趋单一化、不死性、恶性状态。 细胞增殖和分化：是细胞生命进化中所获得的基本属性，增殖使细胞数量增多；分化使机体结构和功能多样化，最后演变成完整的有机体。 五、培养细胞的状态 贴附型 能贴附在支持物表面生长。大多数培养细胞呈贴附性生长；只依赖于贴附才能生长 贴附后，易失去其原有的特征，细胞分化现象常不显著。在形态上表现单一化的现象，并常反应其胚层起源，呈现类似“返祖现象” 成纤维型细胞、上皮型细胞、游走型细胞及多形型细胞 悬浮型 成纤维型细胞 细胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状 成纤维细胞 、心肌、平滑肌、成骨细胞、骨髓基质干细胞等 上皮型细胞 扁平不规则多角形，中有圆形核，细胞紧密相连成单层膜 消化管外皮细胞、肝、胰、肺泡上皮、血管内皮等 游走型细胞 在支持物上散在生长，一般不连接成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快而且不规则 神经胶质细胞 多形型细胞 难以确定其规律和稳定的形态 神经组织细胞 悬浮型 见于各种造血系统肿瘤细胞和血液细胞 胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长 容易大量繁殖 六、培养细胞生长的条件 营养 生存环境 温度: 37 ℃ O2 CO2: 5% CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3- pH: 7.0-7.2 渗透压 无污染 无毒 组织培养室的设施及条件 压力蒸汽消毒器：湿热消毒。用途广 电热干燥箱：干热消毒（160℃，2小时）。主要用干玻璃器皿消毒 滤器：过滤除菌。大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境 紫外灯 ：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒 七、无 菌 操 作 无菌室的灭菌 定期打扫无菌室 实验前灭菌 实验后灭菌 实验人员的无菌准备 肥皂洗手 穿隔离衣 酒精棉球擦手 无菌操作中常犯的错误 吸管、剪刀等碰到其他器皿 无菌操作中常犯的错误 无菌操作中常犯的错误 八、细 胞 和 组 织 培 养 将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。 1、组织块培养 直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。 2、细胞培养 一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直