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大肠杆菌口服疫苗的研制 一、鸡抗猪产肠毒素大肠杆菌（K88）卵黄抗体的研制 Research mathods 3、疫苗的制备 1、 菌株的灭活 在菌液浓度为1×109cfu/mL的细菌悬液中加入终浓度为3‰的甲醛溶液，37℃恒温振荡作用48h。 2、灭活效果鉴定 4、预接种实验 为了检验动物实验设计的科学性和可行性，避免设计不周造成浪费，我们设计了预实验 。预实验证明以6 × 109 cfu的量免疫效果最好，免疫鸡群一开始出现应激反应，采食量下降、精神抑郁，趴卧不起。接种一周后鸡群恢复正常，没有出现实验鸡只死亡。 6、免疫鸡群的抗体效价变化 收集免疫鸡10~13周产的鸡蛋，进行喷干工艺的摸索，最后确定喷干时进口温度设定为160℃，出口温度设定为90℃，对卵黄抗体滴度无影响，并且易于操作。 8、卵黄抗体粉指标测定 结果表明： 1、在非特异性免疫方面，使用重组乳酸菌对小鼠生长初期的脾脏指数和小鼠肠道内sIgA的分泌有持续的促进作用； 2、在特异性免疫方面，重组乳酸菌的效果相比自制的大肠杆菌疫苗效果更加持久，能长时间刺激机体产生高水平的大肠杆菌K88抗体。 实验二、乳酸工程菌诱变选育及工业化生产条件的摸索 重组菌的紫外诱变 选育 耐酸 耐胆盐 遗传稳定性检测 培养基工业化配方的优化 发酵条件的优化 中试 最佳培养基 温度、转速等 确定工业化生产最佳发酵条件 遗传稳定性检测 技术路线 1 重组乳酸菌的诱变选育 1.1 紫外诱变结果 0 180s 0 10-9 66.7% 9 150s 66.7% 9 120s 74% 7 90s 27 10-8 93% 20 180s 84% 48 150s 77.4% 68 120s 300 10-7 致死率 菌落个数 诱变时间 对照 稀释度 结论：诱变结果表明，诱变数据符合诱变成功的前提条件，可以对 存活的菌落进行选育。 1.2、重组乳酸菌的选育 以活菌下降对数值均小于2为标准，从17株乳杆菌中初步筛选出1株优良菌株，其耐酸和耐胆盐测定结果如表 ＜2 ＞2 7.76 7.79 4.88 17 ＜2 ＞2 7.66 7.68 5.26 16 ＜2 ＜2 7.53 7.58 6.14 15 ＜2 ＞2 7.78 7.9 ＜4 14 ＜2 ＞2 7.98 7.98 ＜4 13 ＜2 ＞2 7.89 7.88 ＜4 12 ＜2 ＞2 7.68 7.69 4.48 11 ＜2 ＞2 7.7 7.72 ＜4 10 ＜2 ＞2 7.72 7.7 4.69 9 ＜2 ＞2 7.61 7.57 ＜4 8 ＜2 ＞2 7.84 7.61 ＜4 7 ＜2 ＞2 7.69 7.59 5.11 6 ＜2 ＞2 7.7 7.75 5.01 5 ＜2 ＞2 7.78 7.78 ＜4 4 ＜2 ＞2 7.71 7.77 ＜4 3 ＜2 ＞2 7.67 7.82 ＜4 2 ＜2 ＞2 7.62 7.72 ＜4 1 耐酸对数差 耐胆盐对数差 原液(log) 耐酸(log) 耐胆盐测定（log） 编号 2 重组乳酸菌选育株对小鼠肠粘液的体外粘附实验 4.7× 109 4.7× 109 4.7× 109 原液活菌总数（cfu/mL） 72.8% 1.28× 109 灌肠 63.2% 1.73× 109 粘液2 64.2% 1.63× 109 粘液1 体外粘附率 活菌数（cfu/mL） 名称 3 选育株的遗传稳定性实验 选育株传10代后，在红霉素培养基里的计数情况，表明遗传稳定性较好。 重组菌的紫外诱变 选育 耐酸 耐胆盐 遗传稳定性检测 培养基工业化配方的优化 发酵条件的优化 中试 最佳培养基 温度、转速等 确定工业化生产最佳发酵条件 遗传稳定性检测 技术路线 应用生产常用的发酵条件和培养基，没再单独进行优化实验， 做好种子液后加到500L发酵罐中，发酵12h后，再转入5吨的 发酵罐，每2h取一次样，进行乳酸菌计数和pH值的测定， 并绘制生长曲线。 1 选育株的生长曲线测定 2 选育株的菌液PH值变化情况测定 在5吨大罐中发酵时间以20小时为宜。 实验三、重组乳酸菌作为口服疫苗对小鼠免疫 指标的影响及免疫保护效果的研究 小鼠实验进程一览 9.10开始 动物实验 10.19处理第 一批小鼠 11.6处理 第二批 11.22处 理第三批 10.28-30号，连续三天灌胃，同时进行疫苗免疫 9.24-26号，连续三天灌胃，同时进行疫苗免疫 10.10-12号，连续三天灌胃，同时进行疫苗免疫 11.14-16号，连续三天灌胃，同时进行疫苗免疫 12.4攻毒试验 12.17处理最后一批 1 小鼠脾脏指数（mg/kg）