植物病原细菌学实验分析.pptVIP

植物病原细菌学实验;实验一　植物病原细菌常用培养基 的制作与灭菌?;　1.了解细菌培养基的种类； 2.掌握常用细菌培养基的配方和制作方法； 3.掌握培养基的灭菌方法。;二、实验内容和操作方法 ;2. Hugh和Leifson（HL）培养基：细菌的好氧性和厌氧性测定 蛋白胨 2.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钾 0.2 g 琼脂 3.0 g 蒸馏水 1000.0 ml pH 7.4~7.8 溴百里酚兰（1.6％酒精溶液 1.5 ml） 待培养基融化，并调pH后，装于试管中，每支试管装9 ml 灭菌。培养基凝固后，用接种针蘸细菌悬浮液针刺接种，一直刺到管底。分别在培养2、4和7 d后观察记录。 好氧性细菌，只在开管的上部生长；兼性厌氧性细菌，则在开管的上下部都能生长；厌氧性细菌，则只能在开管的下部和闭管中生长。;（1）配方：NH4H2PO41.0ｇ，氯化钾0.2ｇ，MgSO4.7H2O 0.2ｇ，蒸馏水1000 ｍL，溴百里酚兰（1.6%酒精溶液）1.5 mL; 1%碳素化合物。;（3）分装：将上述培养基分装于试管中，每管10 mL左右。如果测定气体产生，加上杜氏发酵小玻管后灭菌。 产酸时培养液变黄，产碱时变蓝，产气则小玻管内培养液被部分排出，出现空隙。 ;4. MR和VP试验：对葡萄糖的分解能力　;5. 硝酸盐还原;6. 半胱氨酸培养液：测定产H2S能力;7. 吲哚试验;8. 明胶液化; 9. 淀粉水解试验;10. 石蕊牛乳反应 ;（二）培养基的灭菌;明胶培养基灭菌12-15分钟。 石蕊牛乳培养基间歇灭菌3次，每次通蒸汽20-30 分钟。;加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。 通过加热使菌体内蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。 高压蒸汽灭菌法  高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。;当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高到121℃，经20～30min，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。 一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌。 操作方法和注意事项如下: 加水  打开灭菌锅盖，向锅内加水到水位线。注意水要加够，防止灭菌过程中干锅。 ;装料、加盖  灭菌材料放好后，关闭灭菌器盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋，使蒸汽锅密闭，勿使漏气。 排气 打开放气阀。用电炉加热，待水煮沸后，水蒸气和空气一起从排气孔排出，当有大量蒸汽排出时，维持5min，使锅内冷空气完全排净。 ;升压、保压和降压  当锅内冷空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。当压力上升至所需压力时，控制电压以维持恒温，并开始计算灭菌时间，待时间达到要求（一般培养基和器皿灭菌控制在121℃，20min）后，停止加热，待压力降至接近“0”时，打开放气阀。 注意不能过早过急地排气，否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外。 ;干热灭菌法  通过使用干热空气杀灭微生物的方法叫干热灭菌。一般是把待灭菌的物品包装就绪后，放入电烘箱中烘烤，即加热至160～170℃维持1～2h。 干热灭菌法常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌。 凡带有胶皮的物品，液体及固体培养基等都不能用此法灭菌。 ;1 细菌（NA）和真菌(PDA)常用培养基的配方和制 作过程有何异同点？ 2 试述高压蒸汽灭菌的操作方法和注意事项。 ;实验二 植物病原细菌的分离 和致病性测定;二、实验内容和操作方法 ;（1）斑点型：如棉花角斑病。 A. 剪取新鲜的典型病斑，约1cm见方。;　B.表面消毒：将切取的组织块在70％乙醇中浸一下立即取出，然后用表面消毒剂进行表面消毒，可以采用0.1％升汞，15″－2min或0.5％的次亚氯酸盐如漂白粉（1：9稀释液）2min 　C.消毒后用灭菌水洗涤3次，将病组织放在另一个培养皿的灭菌水中，剪破中心或以灭菌玻璃棒研碎病组织静置20－30分钟，等细菌游出。;（2）萎蔫型如茄青枯病 　将茎部剪成1－2寸长，表面用70％酒精轻拭，在火焰上表面消毒，以灭菌刀纵剖，选择轻微变色病部，以灭菌刀切出薄片或以解剖针挑出病健交界处组织（可以不再消毒），加灭菌水浸泡20-30分钟。 　如果茎部较粗，也可以在表面消毒后用解剖刀横断茎部，用夹子或手紧压茎部横断面，挤出溢脓或汁液。;（3）肿瘤组织 ;（4）腐烂组织;2. 分离方法;B.用接种环蘸取上述配制好的菌悬液，在已凝固的平板培养基表面划线 ;（2）培养皿稀释分离法;3.培养;4.细菌的纯化;1. 配制107-108CFU/mL的细菌悬浮液，菌龄48小时左右；;3. 接种方法：用注射器将细菌