线粒体复合体Ⅰ剂盒说明书.docVIP

齐一生物科技（上海）有限公司TEL:021 线粒体复合体Ⅰ试剂盒说明书 测定意义 复合体Ⅰ（EC 1.6.5. 3）又称NADH-CoQ 还原酶或NADH脱氢酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体内膜中最大的蛋白复合物。该酶催化一对电子从NADH传递给CoQ，同时可使O2还原生成O2.-，是呼吸电子传递链上产生O2.-的主要部位。测定该酶活性，不仅可以反映呼吸电子传递链（ETC）状态，而且可以反映活性氧（ROS）生成状态。 测定原理 复合体Ⅰ能够催化NADH脱氢生成NAD+，在340nm下测定NADH的氧化速率计算出该酶活性的大小。 需自备的仪器和用品 紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制 试剂一：25mL×1瓶，-20℃保存； 试剂二：5mL×1瓶，-20℃保存； 试剂三：0.5 mL×1瓶，-20℃保存； 试剂四：25mL×1瓶，-20℃保存； 试剂五：1 mL×1支，-20℃保存； 试剂六：粉剂×1支，-20℃保存，用时加入2mL双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存。 工作液的配制：临用前将试剂五转移到试剂四中混合溶解。 复合体Ⅰ的提取： 准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。 4 ℃ 600 g离心5min。 将上清液移至另一离心管中，4 ℃ 11000 g离心10min。 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅰ（此步可选做）。 在沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（功率20％，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于复合体Ⅰ酶活性测定。 测定步骤： 调零 用蒸馏水于605nm处调零。 样本测定 （1）取40μL酶液和800μL工作液加入1mL玻璃比色皿，在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min。 （2）取出比色皿，加入60μL试剂六，混匀；立即记录340nm处初始吸光值A1，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）中准确反应2min，记录340nm处2min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。 复合体Ⅰ活力单位的计算 1、组织中复合体Ⅰ活力的计算: （1） 按样本蛋白浓度计算 单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。 复合体Ⅰ活力（U/mg prot）=反应总体积（900μL）÷样本体积（40μL）÷反应时间(2min)÷NADH消光系数（6.22×10-3）×ΔA ÷蛋白浓度(mg/mL)=1808×ΔA ÷蛋白浓度(mg/mL) （2） 按样本鲜重计算 单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。 复合体Ⅰ活力（U/g 鲜重）=反应总体积（900μL）÷样本体积（40μL）÷反应时间(2min)÷NADH消光系数（6.22×10-3）×ΔA ÷样本鲜重(g/mL)=1808×ΔA ÷样本鲜重(g/mL) 2、细菌或培养细胞中复合体Ⅰ活力的计算 （1）按样本蛋白浓度计算 单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。 复合体Ⅰ活力（U/mg prot）=反应总体积（900μL）÷样本体积（40μL）÷反应时间(2min)÷NADH消光系数（6.22×10-3）×ΔA÷蛋白浓度(mg/mL)=1808×ΔA÷蛋白浓度(mg/mL) （2） 按细菌或细胞密度计算 单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。 复合体Ⅰ活力（U/104 cell）=反应总体积（900μL）÷样本体积（40μL）÷反应时间(2min)÷NADH消光系数（6.22×10-3）×ΔA ÷细菌或细胞密度(104 cell /mL)=1808×ΔA ÷细菌或细胞密度(104 cell /mL)