第7章-分批发酵、补料分批发酵和高密度发酵-2018-11-21.ppt

以上介绍的一些生物反应器在研究中是很有效的，但在工业化生产中，还是采用通常的搅拌罐与补料工艺来进行高细胞密度发酵。因为其结构简单生产潜力高，适合于进行多参数的控制。 2. 重组大肠杆菌高密度发酵成功的关键技术是补料策略， 根据重组菌的生长特点及产物的表达方式，采用合理的营养物流加方式。碳源和氮源是两种常用的限制性基质，葡萄糖因细菌利用快且价廉易得，已广泛用作重组菌高密度发酵的限制性基质。大肠杆菌在过量葡萄糖的条件下会发生“葡萄糖效应”，积累大量有机酸而影响重组菌的生长和外源蛋白的有效表达因此，大肠杆菌高密度发酵中合理流加碳源使葡萄糖效应降低，是发酵成功的关键，常用的流加模式有3种：恒速流加补料、变速补料和指数流加补料 （1）在恒速流加培养中，（2）变速或梯度增加流 （3）指数流加技术 （1）在恒速流加培养中，作为限制性基质的葡萄糖是以恒定的速率流加，相对于发酵罐中的菌体来说，营养浓度是逐渐降低的，菌体的比生长速率也慢慢下降，总的菌体量在培养过程中是线性增加的。Pan等通过恒速流加培养生产人生长激素，菌体浓度达到120 OD525；Jung等采用该技术生产干扰素，菌体浓度（干重）达到46g/L，干扰素比生产率（单位质量菌体）为17mg/g。 （2）变速或梯度增加流加速率可以在菌体密度较高的情况下，通过加入更多的营养物质促进细胞的生长，并对产物的表达有利。有人采用三阶段式流加葡萄糖的方式，高密度培养重组菌YK537/pDH-B2m生产骨形成蛋白(BMP-2A)、发酵密度达53 OD600，BMP-2A产量（单位体积发酵液）为2.78g/L。 （3）指数流加技术是一个简单而又有效的补料技术，它能够使反应器中基质的浓度控制在较低的水平，这可以大大减少乙酸等有害代谢物的生成，菌体以一定的比生长速率呈指数形式增加，还可以通过控制流加的速率控制细菌的生长速率，使菌体稳定生长的同时有利于外源蛋白的充分表达，该技术已广泛地应用于重组大肠杆菌的高密度发酵生产外源蛋白。 3. 重组E. coli质粒的拷贝数及稳定性 质粒的拷贝数首先取决于自身的遗传特性，同时还受到宿主菌株生理状况及生长环境的影响。一般外源基因的表达量随拷贝数的增加而提高，但拷贝数足够大时这种关系就不明显了。细胞的生理条件会影响质粒的拷贝数，有研究者发现生长速率增大，质粒的拷贝数下降，认为在高比生长速率下，质粒的复制速率跟不上细胞的分裂速率。有人研究了营养限制连续培养中营养对拷贝数的影响，连续培养8天，质粒 (pBR322和pMB9) 没有丢失，但拷贝数下降了4-5倍，说明营养的限制和缺乏会引起重组E. coli质粒拷贝数的下降。工程菌的质粒分配不稳定和结构不稳定都将导致高密度发酵的失败。 一些重组大肠杆菌的高密度发酵情况列表（Lee. TIBTECH, 1996, 14, 98-105） 产物/ 产品 宿主菌 菌体密度[ gDCW/ L ] 培养基 产物产量 人生长激素 MC1061 OD525 = 120 复合 1.08g/ L 人胰岛素样生长因子-1 K12 20 半合成 600mg/ L 人生长激素 MC1061 11 复合 1.75g/ L 人白介素-1α AM27 68 合成 5.6g/ L 人白细胞介素-2 M5248 59.5 半合成 1.2g/ L 人干扰素 J E5505 26 半合成 1 ×109U/ L 人干扰素α-1 TG1 60 合成 5.5 ×108U/ L 人干扰素α-1 TG1 95. 5 合成 2.85 ×106U/ L 人白介素-2 M5248 59.5 半合成 1.2g/ L 人干扰素-2 MM294 OD680 = 75 合成