基因敲除小鼠的实验流程.pptVIP

基本实验流程 一、动物基因组DNA的提取 实验原理 真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组 DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。 获取鼠尾组织 每只小鼠鼠尾加入500ul裂解液和10ul 蛋白酶K(20mg/ml)，55度水浴过夜，至鼠尾溶解。 提DNA步骤： 1. 每管鼠尾加入300ul饱和NaCl，充分混匀，12500rpm 离心20min 2. 取上清700ul至新的离心管中，加入预冷的异丙醇700ul，上下颠倒混匀，动作轻柔，直至看到絮状DNA析出为止, 12500rpm 离心20min，弃上清 3. 加入800ul 75%乙醇于离心管中，洗沉淀，12500rpm离心10min 4. 晾干沉淀，加入100ul的PCR级的水。 二、PCR扩增 PCR:（20ul体系） 2x Mix 10ul 无菌水 2ul 2pmol引物1 2ul 2pmol引物2 2ul 2pmol引物3 2ul 模板DN