乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值.pptVIP

PCR产物自身退火（self annealing） “选择性”PCR：并非万无一失 国内外许多研究者忽略了这个问题，rcDNA被大量扩增，阳性结果不可靠，定量结果也不可靠 Hepatology Research 2003;15: 234-243（PBMC） World J Gastroenterol 2004;10(1):82-85(血清) Kock等：反应管中rcDNA含量不能超过105copy Hepatology 1996;23:405-413 我们的经验： 血清HBV rcDNA超过108copy/ml，进行荧光PCR可能会出现检测结果假阳性 “选择性”PCR：并非万无一失 与定性法比较增加了一个荧光探针，探针位于扩增片段区（负链缺口下游），与cccDNA的负链互补。 选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA rcDNA不能被扩增 无荧光信号 EcoR I 5‘ + P1 P2 3200(1) 5‘ 3‘ 1590 3‘ 1820 P1 1820 1590 + 3200（1） EcoR I P2 cccDNA能被扩增 检测到荧光信号 选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA 实时荧光定量PCR的原理 实时荧光定量PCR的原理 实时荧光定量PCR的原理 标准曲线方程YCt= 42.0827-3.5554logXcopy 相关指数： R2=0.995 灵敏度至少可以达到103copy/ml 我们的结果 ： 选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA ·同样存在PCR产物自身退火引起的rcDNA 非特异性扩增的问题 ·由于灵敏度较普通PCR高，假阳性率比普 通PCR更高 缺陷： 选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA 质粒标准品107copy/ml 3.5×108copy/ml携带者血清 质粒标准品105copy/ml 105~107copy/ml携带者血清 选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA 解决方案 特异性抽提分离cccDNA与其它形式的病毒DNA 采用沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法 酶切纯化cccDNA 采用绿豆核酸酶或ATP依赖的plasmid-safe DNA酶 选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA 1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR) ?侵入者探针法（Invader assaay） 3.嵌合引物荧光PCR法 现有的几种cccDNA检测技术简介 2.侵入者探针法(Invader assay) 两个体系： 两种特殊的探针：invader probe和primary probe，后者含与待测模板无关的5’侧翼的碱基片段。 荧光共振能量转移系统：被核酸内切酶Ⅰ (cleavase,裂解酶)特异地切割5’侧翼碱基片段作为第二个invader，与荧光共振能量转移盒（FRETC）结合，裂解酶切割FRETC上含有荧光基团的短臂，发出荧光信号。 特点：一个模板可以重复使用，每“结合—裂解—结合—裂解”一次为一个循环，每循环一次产生一个荧光信号，呈线性信号放大 侵入者探针法定量检测cccDNA的优缺点 优点：线性信号放大，特异性比荧光 PCR法强 缺点：灵敏度低：104copy/ml 1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR) 2.侵入者分析法（Invader assaay） ?嵌合引物荧光PCR法 现有的几种cccDNA检测技术简介 3. 嵌合引物荧光PCR法 Shao, et al. J Virol Methods 2003； 112：45-52 + P N N：与HBVDNA非同源片段 5’ N 5’ 3’ 3’ p + rcDNA cccDNA P N N P2 5’ 3’ 5’ 3’ 3. 嵌合引物荧光PCR法 嵌合引物荧光PCR的优缺点 优点：克服了荧光PCR法的部分缺陷，灵敏 度比侵入法提高 缺点：仍不能完全避免待测标本中存在的 rcDNA被非特异性扩增 一、几个相关问题简介 什么是HBV cccDNA? 即共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA)。乙肝病毒感染宿主细胞后在细胞内复制并建立感染状态，病毒松弛环状DNA（rcDNA）进入细胞核，利用宿主DNA聚合酶和拓扑酶等“修复”形成的、结构完整的、超螺旋双链DNA分子。 乙型肝炎病毒基因组结构示意图 乙型肝炎病毒的复制过程 我们为什么要关注HBV cccDNA? ? cccDNA存在于细胞核内，成为乙肝病毒的复制