分子生物学第06章分子克隆.ppt

6 分子克隆 分子克隆 大肠杆菌的一般性质 大肠杆菌的遗传标记 大肠杆菌培养基 在液体培养基中生长 在固体培养基上生长 载 体 质粒（plasmid）的一般性质 质粒的遗传标记 质粒的复制类型 质粒的复制类型 严紧型控制复制 松弛型控制复制 质粒的不相容性 质粒不相容原理 质粒载体的选择 Lac操纵子调控模型 α互补的原理 α互补的原理 α互补的应用 质粒pBR322的图谱 重组pBR322质粒转化大肠杆菌后的选择方法（假设外源DNA插入到ampr基因中） pUC19质粒 多克隆位点 pUC19质粒图谱 重组pUC质粒转化大肠杆菌后的选择方法（外源DNA插入到 lac Z 基因中） pUC质粒拷贝数多的机理 pSP质粒 pSP64质粒图谱 pGEM-3z f (+/－)质粒图谱 pGEM-3z f (+/－)质粒多克隆位点序列图 穿梭质粒 穿梭质粒 λ噬菌体 λ噬菌体（λ phage）基因组的一般性质 λ噬菌体（λ phage）基因组的一般性质 λ噬菌体中央区的基因 λDNA的结构 λ噬菌体载体对大肠杆菌培养条件的要求 图6－6 λ噬菌体的生长途径 裂解生长途径 λ噬菌体改建成载体的基础 对重组λ噬菌体大小的要求 将λ噬菌体改建成载体的措施 转化、转染和转导 插入型载体和取代型载体 λ载体的优点 合适载体的选择 插入型载体λgt10和λgt11图谱 λgt10的特点 λgt10的特点 λgt11的特点 λZAP噬菌体载体结构和其中的pBluescript噬菌粒 λZAP载体的特点 λZAP载体的特点 λZAP载体的特点 粘粒（cosmid）载体的特点 图 6｜ 粘粒载体及其克隆步骤 粘粒（cosmid）载体的特点 粘粒（cosmid）载体的特点 单链丝状噬菌体M13载体的特点 图6－10 M13mp18载体图谱 M13单链噬菌体载体的构建 M13噬菌体RF DNA的复制 M13噬菌体RF DNA 的复制 M13噬菌体正链DNA的复制 感染M13噬菌体形成浑浊噬菌斑 DNA分子的连接 平端产生的方法 平端加连接子后连接 平端加适配器后连接 平端的同聚物加尾连接 相同粘性末端的连接 不同粘性末端的连接 重组DNA导入受体细胞 CaCl2法（化学法） 高压电穿孔法（物理法） 三亲本杂交接合法 三亲本杂交接合法 三亲本杂交法转化大肠杆菌 阳性重组体的筛选和鉴定 抗生素筛选 抗生素筛选 β－半乳糖苷酶系统筛选 小量制备载体DNA作限制酶切分析 Southern印迹杂交分析 原位杂交分析 Spi 筛选 在M13噬菌体的基因Ⅱ和基因Ⅳ之间有一个507bp的间隔，对M13进行改造以使其成为载体主要是在这一位置进行，在此位置插入标记基因lacZ和多克隆位点，但不要影响复制起始区的功能，因为复制起始区也在这一位置。 M13噬菌体载体可以携带约30kb的外源DNA。 当M13噬菌体以吸附细胞壁上性纤毛的方式，感染雄性大肠杆菌（F+）后，在细菌胞内酶的作用下合成负链DNA而成为双链DNA，称为复制型DNA（replication form DNA，RF DNA）病毒基因以RF DNA负链为模板转录，当基因Ⅱ产物在亲代RF DNA的正链特定位点上产生一个切口时，病毒基因组的扩增即开始。新合成的正链逐渐取代原有的正链。当复制叉绕负链模板整整一周时，基因Ⅱ产物将被取代的正链切下，经环化及合成负链后，又产生了一个RF DNA，依此继续扩增。 当细菌细胞内RF DNA的拷贝数达到100~200个时，细胞内也产生了足够量的单链DNA结合蛋白（基因Ⅴ产物），这些蛋白有两个作用，一是抑制基因ⅡmRNA的翻译，二是与新合成的正链DNA结合，阻止它再转变成RF DNA。此时RF DNA的数量保持不变，但单链正链DNA的合成不断进行。产生的子代单链DNA在溢出宿主细胞时被衣壳蛋白包被，衣壳蛋白是基因Ⅲ和基因Ⅷ的产物。 感染M13噬菌体的细菌并不被裂解，可继续生长，但感染了M13噬菌体的细菌的生长速率为正常生长速率的1/2。在琼脂或琼脂糖覆盖层内生长的未感染细菌生长较快，形成较为浑浊的背景，相对于这一背景，由生长缓慢的感染细菌形成一个不断扩大的环带，最终形成肉眼可见的噬菌斑。每个感染细胞内每一代可产生数百个病毒颗粒，因此，在培养基中将积聚大量的病毒颗粒。 粘性末端的连接可使用大肠杆菌DNA连接酶。 DNA连接酶催化DNA连接反应时要加ATP。 平端的连接应采用 T4 噬菌体DNA连接酶。 平端连接相对于粘端连接是低效反应，它要求 4个条件：低浓度的ATP、高浓度的连接酶、高浓度的平端底物、没有亚精胺类的多胺。 加入适量的聚乙二醇（PEG）能促进平端的连接。 ① 用适当的限制性内切酶直接切出平端； ② 对5