藻胆蛋白的生物合成与光谱分析张阳杰.docVIP

综合实验：藻胆蛋白α亚基生物合成及光谱分析 PAGE PAGE 0 第 页 共 NUMPAGES 16 页 藻胆蛋白α亚基生物合成及光谱分析 报告题目 藻胆蛋白α亚基生物合成及光谱分析 作者姓名 张阳杰 班级学号 2011114020525 指导教师 苏平 完成时间 2014.3 生物学实验教学中心 综合实验：藻胆蛋白α亚基生物合成及光谱分析 PAGE 1 目 录 引言3 1. 实验仪器与试剂5 1.1 实验仪器 5 1.2 实验材料及试剂5 1.2.1 实验材料5 1.2.2 抗生素储备液5 1.2.3 IPTG储备液6 1.2.4 缓冲液6 1.2.5 SDS电泳溶液6 2. 实验方法7 2.1菌种活化与扩大培养7 2.2藻胆蛋白α亚基生物合成8 2.3藻胆蛋白α亚基提纯8 2.4色素蛋白电泳检测8 2.5藻胆蛋白α亚基光谱测定9 3. 结果与分析9 3.1藻胆蛋白α亚基产物图9 3.2藻胆蛋白α亚基光谱图10 3.3透析后藻胆蛋白α亚基光谱图11 4. 实验讨论12 参考文献13 藻胆蛋白α亚基生物合成及光谱分析 张阳杰（指导老师：苏平） （湖北师范学院生命科学学院 生物技术 1105班 湖北黄石 435002） 摘要：本实验通过构建质粒来实现在大肠杆菌内合成具有活性的α—PEC。藻胆蛋白(包括本文研究的α—PEC)在蓝藻内的作用是吸收光、传递能量至光合作用反应中心，所以本实验检验重组是否成功主要检验吸收光谱是否与天然藻胆蛋白一致。 藻胆蛋白(Phycobiliprotein)是存在于蓝藻、红藻和隐藻中的一类捕光色素蛋白，可分为藻红蛋白(简称PE)，藻蓝蛋白(简称PC)，别藻蓝蛋白(简称APC)和藻红蓝蛋白(简称PEC)。重组有藻胆蛋白（本实验只做藻红蛋白）基因的E. coli BL21，在含有kana（24 μg/ml）和氯霉素（40.8μg/ml）的LB培养基中培养。当OD600达到0.5-0.6时，用终浓度为1 mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养2.5小时。加超声缓冲液后用超声破壁离心取上清，得到藻红蛋白粗提液。通过镍-亲和层析对起进行纯化。 关键词：藻胆蛋白 重组质粒 光谱分析 引言 藻胆蛋白(Phycoerythrocyanin) 是一类结构相似的色素蛋白。它是由藻胆色素通过和相应的脱辅基蛋白中保守性半胱氨酸的巯基以硫醚键共价结合形成的。 藻胆色素是一类线性四吡咯化合物（分子量约600Da）。藻胆体中一般含有300～800个共价偶联的藻胆色素。与蓝藻藻胆蛋白结合的色素有4种。这四种色素分别是：藻红胆素（phycoerythrobilin，简称PEB）主要存在于PE中，藻蓝胆素（phycocyanobilin，简称PCB）主要存在于PC，APC和PEC中，藻尿胆素（phycourobilin，简称PUB）主要存在于B-PE和R-PE中，藻紫胆素（phycoviolobilin，简称PVB）仅存在于PEC中。 根据色素种类及其与藻胆蛋白的相互作用，藻胆蛋白可分为藻蓝蛋白（phycocyanin，简称PC）、藻红蛋白（phycoerythrin，简称PE）和别藻蓝蛋白（allophycocyanin，简称APC），在某些没有藻红蛋白而具有异形胞的蓝藻中，还有藻红蓝蛋白（phycoerythrocyanin，简称PEC）。根据Fueglistaller等人[2]对层理鞭枝藻的研究表明：藻胆蛋白由两个亚基组成，α一亚基(简称α—PEC)含162个氨基酸残基及一个辅基色素藻紫胆素(简称PVB)，在Cys一84位以硫醚键共价相连，经分离提纯的α亚基具有可逆光致变色性质[3]；β亚基(简称β—PEC)含171个氨基酸残基及两个辅基色素藻蓝胆素(简称PCB)，分别在Cys．84和Cys一155位以硫醚键共价相连。在藻胆蛋白氨基酸的一级结构中多肽链中部Cys．84是藻胆色素的主要结合位点。 藻胆蛋白通过脱辅基蛋白质三级结构和藻胆色素相互作用，形成特定的构象，使其主要吸收450～660nm范围内的可见光。其所能捕获的光能正好可以填补叶绿素和类胡萝卜素所不能捕获的光能区（图1）。捕获的光能由高能色素流向低能色素，最终传递到光合作用中心。 图1. 色素蛋白吸收光谱 藻胆色素来源于血红素，血红素被氧化而共轭环断裂形成胆绿素，这一过程是由相应的血红素氧化酶催化。胆绿素被特定的酶部分还原和异构化形成特定的藻胆色素。 利用在大肠杆菌中表达的藻胆蛋白α一亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素PCB重组，吸收光谱、荧光光谱和高效可逆光化学性质分