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临床免疫学检验技术
; 肖建华;; ;概 述; ;;一、生物素理化性质 ; ;生物素侧链末端羧基经化学修饰后制成带各种活性基团的衍生物—活化生物素。;活化生物素易与抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标记物。 ;C;BNHS分子可与蛋白质赖氨酸的氨基形成肽键。
BNHS适用标记抗体和中性或偏碱性的蛋白质。;如何减小空间位阻;;2. 标记蛋白质醛基的活化生物素;3. 标记蛋白质巯基的活化生物素
马来酰亚胺-丙酰-生物胞素(MPB) :能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素。
4. 标记核酸的活化生物素
(1)光敏生物素(photobiotin):
侧链上连接的芳香基叠氮物基团,经光照后变为芳香基硝基苯,与腺嘌呤N-7位氨基结合,形成生物素化的核酸探针,用于DNA或RNA的标记。;(2)生物素脱氧核苷三磷酸(Bio-dUTP):作为TTP的结构类似物,可采用缺口移位法通过DNaseⅠ和DNA聚合酶Ⅰ的作用而掺入到双链DNA中。
(3) BNHS和BHZ:与核酸胞嘧啶分子中的N-4位氨基结合,形成生物素标记的核酸探针,但对碱基配对有影响。(不常用);活化生物素通过侧链与蛋白分子连接;
一个蛋白分子可被多个生物素标记-多价;
可标记生物活性大分子,如抗原、抗体。BNHS多标记抗体,BHZ则多标记偏酸性抗原,标记后抗原、抗体活性不变;
可对示踪物标记,碱性磷酸酶标记后活性将降低。; 讲授内容;亲合素(avidin, A / AV) 和链霉亲合素(streptavidin, SA)是生物素的天然特异性结合物。(实际应用中多用链霉亲合素)
二者均为大分子蛋白,目前所有用于标记的物质均可与亲合素(AV)或链酶亲合素(SA)结合。
能与生物活性分子抗原、抗体结合,也能与示踪物结合。多与酶、荧光素及胶体金偶联。;结构 四亚基糖蛋白 四肽链蛋白 无糖基
分子量 68 kD 65 kD
pI 10.5 6
结合位 色氨酸 色氨酸
生物素 4 4
Ka 1015 1015
活性U 13~15 15~18;AV/SA耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用,与生物素结合后稳定性更好,每个亲和素能结合四个分子的生物素。;BAS-WB WB;四、适???性广;;生物素与亲合素之间的结合亲合力高、特异性强;
两者各自均可与各型大小分子结合,且二者的结合反应具有多级放大作用;
已广泛应用于各种标记免疫分析技术,BAS在免疫标记技术中既可用于检测系统的信号放大,又可用于固相载体的包被。;一、固相载体包被
固相吸附分离是非均相免疫分析重要的分离方法。引入生物素-亲合素(链霉亲合素)系统连接于固相载体表面,再与欲包被的抗原或抗体结合,实现间接包被,可极大地提高非均相免疫分析的敏感性。包被方法有:
(一)生物素-链霉亲合素-生物素化抗体(Ag)包被法
(二)链霉亲合素-生物素化抗体(或Ag)包被法;1.生物素-链霉亲合素-生物素化抗体(或Ag)包被法;;链霉亲合素-生物素化抗体包被法(BA包被法)比生物素-链霉亲合素-生物素化抗体包被法(B-BAB包被法) 简便、高效、省时省材;
BAS连接固相载体的包被模式,可增加抗体(或Ag)包被数量,减少空间位阻效应,提高检测的灵敏度和准确度;
链霉亲合素预包被磁性纳米微球可作为通用试剂,用于反应体系成分的分离、纯化及不同项目的检测,如发光免疫分析。;;;;;1. BAB法;; (一)生物素-亲合素-生物素模式;; BA 或LAB法;BAB法与BA法比较
BAB法:以游离亲和素为桥,分别连接生物素化抗体和生物素化酶。
BA法 :以酶标AV/ SA代替BAB法中的游离亲和素,省却了加生物素化酶的步骤。
;BSA在酶免疫测定中的应用
BSA在荧光免疫技术中的应用
BSA在放射免疫测定中的应用
BAS在化学发光免疫分析中的应用
BAS在胶体金免疫技术中的应用
BSA在分子生物学中的应用
BAS在其它方面的应用:分子和细胞的分离与纯化、肿瘤诊断与治疗、增强杂交细胞融合率等;;小 结;思 考 题;Thank you !
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