人FⅧ基因的表达不依赖其5′端CpG岛的甲基化何玉霞12周云飞1.docVIP

人FⅧ基因的表达不依赖其5′端CpG岛的甲基化 何玉霞1,2，周云飞1,2，王 娟1,2，代晓璐1,2，张 军2 ( 400016 重庆，重庆医科大学: 分子医学与肿瘤研究中心1 ，细胞生物学及遗传学教研室2 ) 摘 要：目的 建立稳定的重亚硫酸盐测序（Bisulfite-sequencing PCR,BSP）检测平台，以人类永生化肝细胞LO2与新鲜分离的正常人肝组织为研究对象，对比检测二者凝血因子Ⅷ（Coagulation factor Ⅷ, FⅧ）基因5′端CpG岛的甲基化水平，探究甲基化的CpG岛对FⅧ表达的调控作用。方法 RT-PCR、Western-blot检测FⅧ在LO2细胞与肝组织中的转录及表达；Methprimer软件预测FⅧ基因5′端CpG岛并设计BSP引物，BSP联合TA克隆检测LO2细胞与正常人肝组织中该CpG岛的甲基化状态，质粒PCR各验证十个阳性单克隆并送测序；QUMA软件对测序结果进行甲基化位点分析，以（甲基化CG位点个数）/（甲基化CG位点个数+非甲基化位点个数）计算各个CpG位点的甲基化率；SPSS软件对单个CpG位点甲基化率进行四格表的确切概率（双侧）卡方检验。结果 新鲜分离的人肝组织能够表达FⅧ，而LO2细胞不能；人FⅧ基因5′端存在一个278bp的CpG岛，共23个CpG位点，LO2细胞中该CpG岛的整体甲基化水平为80%～100%，正常人肝