第7讲 基因编辑技术.pptx

第七讲 基因编辑技术;;1. 基因打靶技术;同源重组：是指相似的DNA交换遗传信息的过程, 外源DNA片段可与宿主基因组的相应片段发生交换（即重组）。 ;关键一 筛选;正负双向选择系统（positive-negative-selection）;正负双向选择系统（positive-negative-selection）;关键二 产生纯合子;基因打靶技术的延伸;条件性敲除;诱导性敲除;诱导性敲除;;2. 反义吗啡林技术;2. 反义吗啡林技术;2. 反义吗啡林技术;2. 反义吗啡林技术;2. 反义吗啡林技术;;3. RNAi技术;美国科学家Andrew Fire和Craig C. Mello因为发现“RNA 干扰机制——双链 RNA 沉默基因”而获得 2006 年诺贝尔生理学或医学奖。;RNA诱导的沉默复合体;siRNA制备方式;慢病毒引导的siRNA干扰;非编码区：5’端：R；U5; SD ; ψ。3’端：非翻译区；聚嘌呤；U3。 编码区 gag, -----群抗原基因，编码核心蛋白p24 pol -----多聚酶基因，编码多聚酶； env-----包膜蛋白基因，编码包膜蛋白gp120 及gp41； tat ----- 基因反式激活因子对HIV-1基因其正调控作用 rev,----- 病毒蛋白表达调节因子，能增加gag和env基因对结构蛋白的表达 vif,----- 病毒感染因子, 其作用是在一些细胞因子的协下促进HIV-1在细胞内复制 Vpr,----- R蛋白能使HIV在巨噬细胞中增殖 vpu,----- U蛋白，能促进HIV从细胞膜上释放 nef,----负因子，具有抑制HIV-1增殖作用;Expression vector;;;4. 锌指核酸酶技术;4. 锌指核酸酶技术;4. 锌指核酸酶技术;4. 锌指核酸酶技术;;5. TALEN技术;Dong Deng et al., Science 5 January 2012 ,121:5670;;Science, Vol. 333, No. 6051. (30 September 2011), pp. 1843-1846;;6.1 CRISPR-Cas系统的研究历史;6.1 CRISPR-Cas系统的研究历史;CRISPR-CAS 系统的组成主要包括: 由不连续的重复序列R( repeat) 与长度相似的间区序列S( spacers) 间隔排列而成的CRISPR 簇，前导序列L( leader) 以及一系列CRISPR 相关蛋白基因cas。; CRISPR 的高度可变的间隔区的获得 ; CRIPSR 基因座的表达 当该噬菌体再次入侵细菌时，CRISPR 簇首先转录为长的crRNA前体，然后逐步被加工成小的成熟的crRNA。 CRISPR/Cas系统活性发挥 crRNA结合相关的Cas 蛋白后，形成crRNA-Cas 蛋白复合体，通过碱基互补配对精确地与目标DNA相结合，随后Cas蛋白对目标DNA进行断裂和降解。;6.3 CRISPR-Cas系统的作用机理;Mali等人利用来自酿脓链球菌和嗜热链球菌中的CRISPR 相关蛋白Cas9，在一段人为重组的sgRNA(small-guide RNA) 的引导下，针对小鼠和人类基因组的特定基因片段实现了精确的剪切。这种通过可编程RNA进行DNA改造的技术为基因组编辑开创了一条新的途径。;1、靶基因中寻找NGG序列获得其附近20多个碱基的序列，与tracrRNA序列融合，设计出sgRNA并合成该序列。 2、将该序列以及cas9基因连入如图所示载体。 3、转化感受态，质粒小提，测序验证。 4、细胞培养与细胞转染 5、敲除效果检测。 6、建立稳定敲除的细胞株;失去DNA切割活性的Cas9蛋白——Dead Cas9（dCas9）;6.6 优势与前景;目前应用CRISPR-Cas9系统的研究主要集中在基因编辑方面。而Cas9真正的优势主要在于它具有能够将3种主要生物大分子（DNA、RNA和蛋白质）结合在一起的特殊能力。 各种功能性蛋白都可以通过与Cas9蛋白融合，然后利用gRNA的靶向作用结合到dsDNA的任意位点，发挥人们预期的功能。;Thank you!