DNA重组的操作讲义.ppt

第一节 DNA的体外重组 　三、DNA体外连接应注意的事项 　　2. DNA插入的方向正确 由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。 用双酶切 EcoRI BamHI EcoRI BamHI EcoRI BamHI 第一节 DNA的体外重组 　三、DNA体外连接应注意的事项 　　3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确 （1）DNA定向插入 　（2）起始密码 　　　尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。 ATGGAATTC 载体 ATGCGGAATTCT 插入片断 EcoRI EcoRI ATGGAATTC T 重组 但移码突变！ 第一节 DNA的体外重组 　三、DNA体外连接应注意的事项 　　4. 防止载体自身环化连接 　（1）提高插入片断的用量 　　　　连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。 　（2）用碱性磷酸酶处理载体 　　　载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。 第一节 DNA的体外重组 　四、载体和外源DNA插入片段的连接结果 1. 载体自身环化连接（能存活） 2. 载体之间互相连接（能存活） 3. 插入片段互相连接（不能存活） 4. 一个载体与几个插入片段重组（能存活） 5. 几个载体与一个插入片段重组（能存活） 第一节 DNA的体外重组 * 在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆