实验四水稻悬浮细胞的培养.ppt

上次实验总结 实验名称：实验三 线粒体的分离与观察 实验结果： 实验四 水稻悬浮细胞的培养 指导教师：何春梅 林建中 1 实验目的 初步掌握无菌操作方法。 了解水稻细胞在离体条件下的生长特性。 掌握植物细胞悬浮系的建立以及种细胞的筛选方法。 2 实验原理 植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。 一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。在培养过程中不断进行旋转震荡，一般可用100-120 r/min 的速度进行。由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。 从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。 该项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。 该技术可用于类似于大规模发酵培养的方式培养植物细胞，用于生产药物蛋白和次生代谢物。 植物细胞悬浮培养的基本过程 ⑴ 起始培养物的建立 选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体。 选择适宜的培养基：较高浓度激素浓度；必要的附加物质。 愈伤组织的要求：松散性好、增殖快、再生能力强 ⑵ 悬浮系的建立 经过多次继代悬浮培养后才能建立分散均匀的悬浮细胞系。 ⑶ 悬浮细胞的生长与增殖 悬浮培养与固体培养比较有三个优点： (1)增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应； (2)在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害； (3)振荡培养可以适当改善气体的交换。 该技术可用于类似于大规模发酵培养的方式培养植物细胞，用于生产药物蛋白和次生代谢物。 ⑷ 影响悬浮细胞生长的因素 ·起始愈伤组织的质量 · 接种细胞密度 · 培养条件：方式、温度 · 继代周期 3 实验材料,仪器和试剂 3.1 实验材料： 水稻愈伤组织（已转入了RFP基因的愈伤组织，呈现出红色）。 愈伤组织 转化用表达载体 3.2 实验仪器： 超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、磁力搅拌器、恒温空气摇床、镊子、锥形瓶 3.3 实验药品和试剂 (1) 用于水稻悬浮培养的液体培养基 (2) 70%酒精 (3) 工业酒精（及酒精灯） 4 实验步骤 4.1 无菌操作前的准备 ⑴ 用70-75%酒精擦洗超净工作台。 ⑵ 打开紫外灯照射15min。 ⑶ 打开风机吹风5min。 ⑷ 准备酒精灯、镊子和消毒用的70-75%酒精和酒精棉球。 ⑸ 用酒精棉球擦洗双手，准备进行无菌操作。 4.2 接种愈伤组织 (1)点燃酒精灯，在火焰的的下风口小心打开三角瓶的风口膜。 (2) 在火焰的的下风口小心打开培养皿。 (3) 用预先在火焰上烤过的镊子（一定要冷却）选取生长旺盛、分散性良好的愈伤组织，挑取2-3块接种于液体培养基中。 (4) 在火焰的的下风口小心盖上三角瓶的风口膜，并用橡皮筋扎紧。 4.3 悬浮细胞的培养和观察 (1) 将接种了愈伤组织的三角瓶至于28℃摇床中，于100-120rpm震荡培养1周。 (2) 培养1周后，取1滴悬浮细胞培养液制成装片，于显微镜下观察悬浮细胞的形态结构。 (3) 取悬浮细胞培养液装片至于荧光显微镜，在绿光激发下观察其红的荧光。 5 实验数据的记录和分析 明视野下，拍照分散性良好的悬浮细胞，检查是否混杂大块的愈伤组织。 在荧光显微镜下拍照转基因愈伤组织的RFP发出的绿色荧光。 以前的实验结果 2008级张启行实验组 2008级胡帅行实验组 明视野 绿光激发下的红色荧光 思考题： （1）怎样识别细菌污染？怎样避免细菌污染？ （2）从分子生物学的角度分析，为什么我们所用的悬浮细胞能够看到红色荧光？ 细菌污染 无污染