第七章原位杂交技术.ppt

一些关键问题，灵敏度和特异性 trouble shooting 1. 防止靶mRNA分子降解 2. 样品固定 3. 通透处理 4. 探针及标记物 样品 条件 5. 杂交条件，严格度 探针 高严格度条件下，碱基完全互补的双链才能形成杂交体；低严格度条件下，碱基对不完全互补的双链也能形成杂交体。 *杂交条件的严格度:严格度概念 严格度（stringency，也叫严紧度）： 决定探针是否与含不相配碱基的核酸序列结合的条件，是决定杂交双链间形成氢键稳定性的条件，从而最终影响特异性。 造成严格度的条件 1.温度 2.离子强度（SSC溶液的浓度） 3.甲酰胺 高严格度： 高的温度 高的甲酰胺浓度 低的离子强度 42℃ 35℃ 一般原则，本实验室采取的原则： *杂交：低严格度 *漂洗：高严格度 用浓度递减的SSC溶液（2×,1×，0.5×,0.2）； 振荡漂洗 如果杂交信号太弱或没有，可以降低漂洗的严格度； 如果背景太强、信号不特异，可提高漂洗的严格度 没有信号，灵敏度不够，如何分析？ 信号过多，特异性不够（背景染色，噪声大），如何分析？ 样品：降解、固定、通透；待检测信号的丰度 探针：长度、标记物 抗体：稀释度 杂交条件：严格度 探针：长度、标记物的内源干扰 抗体：稀释度 杂交条件：严格度 显色时间： 如： 如： 3.技术的灵敏度和特异性 灵敏度(Sensitivity): 是否有信号 特异性 (Specificity)：信号是否特异 2.技术的基本原理 1.技术的适用范围 原位杂交技术 原位检测核酸分子 核酸杂交反应 +免疫细胞化学显色反应或放射自显影 核酸标记物：荧光素、地高辛、BrdU、同位素 报告分子：荧光素、酶、胶体金-抗体 最终显示：荧光、棕黄色/蓝紫色、金颗粒 同位素潜影 思考题 原位杂交技术中如何应用了其他几种细胞化学技术？ 为什么说原位杂交技术是分子生物学和细胞化学技术的结合？ 原位杂交技术中，先将标记的核酸探针与组织细胞中靶核酸分子结合形成杂交体，这是分子生物学技术，然后用同位素或免疫细胞化学技术探测杂交体 如 用地高辛标记核酸探针，杂交后用碱性磷酸酶联结的小鼠抗地高辛抗体与探针结合，这里应用的是免疫细胞化学技术 为了使酶可见，再加入其底物四唑氮蓝和吲哚酚，最终形成蓝紫色物质，这就是酶细胞化学技术 这样，通过酶细胞化学最终产生蓝紫色物质，间接探测了酶的定位，又通过酶联抗体与探针的免疫组化反应，间接探测了探针，进而间接探测了靶核酸的定位 思考题 如何应用各种细胞化学技术研究一个酶的基因表达？ 第二部分内容完 * 第七章 原位杂交技术 (In situ hybridization，ISH) 核酸分子杂交 DNA双链在一定条件下可发生变性和复性 变性 复性 杂交: 异质核酸单链缔和成双链的过程. 杂交 原位杂交技术是将分子生物学与细胞 化学技术结合起来，以标记的核酸分子为 探针，在组织细胞原位，与细胞内需探测的核酸杂交以检测特异核酸分子的技术，可以反映特异核酸分子的量、同时也可以反映与组织、细胞、细胞器或染色体结构的位置关系 。 原位杂交技术 光镜或电镜水平均可用，目前多用于光镜 (In situ hybridization，ISH) 基因表达 对特定生理或病理条件下从DNA到mRNA到蛋白质这样一个基因表达过程进行定性和定位的分析，是研究基因表达强有力的手段，如细胞学,产前诊断,肿瘤,病毒学等，特别是将肿瘤的病因学、发病学、诊断学和治疗学等方面的研究提高到基因水平。 原位杂交技术的应用 第一节 原位杂交技术的原理※ 使含有特异序列、经过标记的核酸单链即 探针，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸 单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免 疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在 细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。 一、 核