流式细胞术本科教学课件.ppt

标记方法 影响因素 直接免疫荧光标记 间接免疫荧光标记 浓度：抗原抗体最适比 温度：4度 时间：30min pH值：最适，不同； 固定剂 ：醛类、醇类； 胞内/胞外染色； 流式细胞仪的校准和质量控制 1. 校准 用已知散射光和荧光强度的标准微球对光路、散射光灵敏度、荧光线性和灵敏度校准。 2. 质量控制 a. 样品制备： b. 对照设置：阴性对照、 阳性对照、同型对照、单阳对照 c. 室内质控： 同型对照（抗体）：与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的未免疫的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。 数据的采集 1. 光路校正； 2. 建立获取模版, 设定获取细胞总数； 3. 利用未染色细胞(阴性管)调整仪器PMT电压; 4.用同型对照调节本底染色背景； 5.用单染色的细胞(单阳管)调节仪器补偿； 6. 上样检测并采集数据； 分析数据 设门 (gating)： 1. 在细胞分布的散点图中指定一个区域，对其中的细胞进行单参数或多参数分析。 2. 在线设门、离线设门 3. 线性门、矩形门、圆形门、任意形状门 数据的显示和分析 单参数测量数据的显示和分析： 单参数直方图 1. 纵轴代表被测细胞的相对数量； 2. 横轴代表荧光信号强度的相对值。 双参数测量数据的显示和分析： 双参数散点图 横轴/纵轴分别代表一个荧光参数； 每个点代表一个细胞。 二维等高图、等密度图、假三维立体图 多参数测量数据的显示和分析： 利用设门技术通过单参数直方图和双参数散点图等进行分析。 3.流式细胞术的临床应用： 一、在临床血液学中的应用； 二、在临床免疫学中的应用； 三、在临床肿瘤学中的应用； 四、在器官移植中的应用； 五、在临床微生物学中的应用； 一、在临床血液学中的应用； 1. 在白血病和淋巴瘤的免疫分型诊断中的应用； 形态免疫细胞（ MIC）分型，微量白血病细胞（MRD）的检查； 2. 阵发性睡眠性血红蛋白尿症的诊断； 糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白: CD55/CD59 3. 在血小板功能及相关疾病检测中的应用； 二、在临床免疫学中的应用； 1. 淋巴细胞及其亚群: T淋巴细胞：CD3/4/8/45/29/25； B淋巴细胞：CD5/19/20/21/22； NK细胞：CD3/16/56 2. 淋巴细胞功能分析：CD25/CD69/CD71；胞内细胞因子的检测； 3.免疫系统疾病的诊断：免疫缺陷病；AIDS，CD4/CD8比值; 强直，HLA-B27; 三、在临床肿瘤学中的应用； 1. 细胞周期与DNA倍体分析： G0/G1→ S →G2 →M → G0/G1 2G → 2G~4G → 4G PI染色 2. 肿瘤耐药相关蛋白分析： 红色为正常二倍体细胞； 黄色为异倍体细胞 四、在器官移植中的应用 1. 流式细胞交叉配型技术（FCCM）; 2. CD34+造血干细胞计数； 五、在临床微生物学中的应用； CBA技术； 药敏检测； 病毒、细菌的检测； 流式细胞术 1.流式细胞术的基本原理（掌握）； 2.流式细胞术的技术要点（掌握）； 3.流式细胞术的临床应用（了解）； 第一节、流式细胞术的基本原理 流式细胞仪（FCM, Flow cytometer） 是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、抗体技术为一体的新型高科技仪器。 流式细胞术 （FCM, Flow cytometry） 用流式细胞仪测量液相中的悬浮细胞或颗粒的一种现代分析技术，可在细胞保持完整的情况下，精确、快速地对流动中的单个细胞进行分子水平的多参数、定量分析，并可对特定群体进行分选。 流式细胞术的特点和分类 分析对象：单细胞悬液或生物颗粒； 分析/分选速度：快速，20/10万个/秒； 检测参数：多参数（两个散色光参数，多个荧光参数）； 检测结果：精度高，准确性好 应用：临床、科研 流式细胞术的检测范围 细胞结构 大小 粒度 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 钙离子，pH值，膜电位 细胞功能 细胞表面/胞内特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 细胞受体 细胞凋亡 流式细胞术的基本工作原理 根据待测细胞的生物学特性或细胞生化成分，选择特定荧光染料或与荧光染料耦联的多/单克隆抗体标记细胞，以激光作为激发光源，利用显微荧光光度测定技术、光电技术以及计算机技术测定流动相中单个细胞受激后的光信号来分析细胞的物理、生化、免疫、分子生物等多种特性，并可根据某些特征进行细胞亚群分选。 流式细胞仪主要构成系统 流动室和液流驱动系统 光学系统