蛋白质组学讲义.ppt

* 当不同状态的细胞被裂解后，分别加入不同标记的ICAT与总蛋白质反应。ICAT的反应基团会专一与蛋白质中的Cys共价结合，待充分反应后，将二者等量混合，再用胰蛋白酶酶解，HPLC分离，就可对含生物素ICAT酶解片段进行串联质谱分析。 一对ICAT标记来源不同细胞状态下的相同肽段总是一前一后相邻分布在质谱图上，且分子量正好相差8或4 D(肽段带两个电荷)。通过MS／MS鉴定出该片段属于何种蛋白质后，计算二者峰值的差异，就可知这种蛋白质在二种细胞状态下表达的情况。 蛋白质组学Proteomics 蛋白质组学的发展 1995年，蛋白质组学的概念被提出，它在本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。 2001年，Nature，Science分别发表了” And now for the proteome” “Proteomics in genomeland” 双向凝胶电泳 首先利用等电点聚焦来分离不同等电点的蛋白，再利用SDS－PAGE来分离不同分子量的蛋白，其分辨率是非常高的。微克级的蛋白质就可以被很好的分辨开了。 基质辅助的激光解吸电离技术（MALDI）的发展 日本岛津公司的田中耕一的工作，是质谱分析发展的一个主动力。 1987年，在第二届中－日质谱分析联合讨论会上，田中耕一论述了软激光解吸附技术可以使蛋白质分子离子化。一年之后，他的这篇创造性的论文发表在Rapid Communications in Mass Spectrometry上。田中耕一的工作为基质辅助的激光解吸电离技术（Maldi）打下了基础。2002年，他和弗吉尼亚联邦大学的John B Fenn，由于他们对软吸附电离方法上的贡献一起被授予了该年度诺贝尔化学奖 在Maldi发明之前，蛋白质分子由于其较高的分子量实际上被排除在质谱分析之外，而且使用传统的技术也难以对蛋白质进行研究。 早期的激光解吸附质谱分析，将研究局限在相对分子量大约为5000～10000的范围内，这个限制就排除了对大多数蛋白质的研究，因为大多数的蛋白质分子在电离过程中容易散射而分解掉。 Maldi使得对生物大分子的电离成为了可能。这是因为Maldi可以使不具挥发性的生物样品汽化、电离，直接进入气态。要分析的样品和基质——通常是丙三醇和钴粉混合在一起。这种基质可以吸收来自氮气激光的337nm 波长的紫外激光并将其转化为热能，同时一小部分基质包括最上表面的分析物被迅速加热，从样品中气化。由于基质吸收了大多数的瞬时激光的能量，分子量高达1000000道尔顿的分子也能被成功地分解。 Madil 和Tof质量分析器的联用 Maldi大多数情况下是和Tof（飞行时间）质量分析器联用的。在Maldi－Tof装置中，离子的形成、分离和检测都是在高真空环境中完成的。当从离子源加速之后，由于势能的差别，就在飞行管中以不同的速度进行飞行。离子的质量越小，就以越快的速度穿过飞行管到达检测器。因此，各不相同的离子质量，也就对应了不同的飞行时间，这就是离子分离的原理。Maldi－Tof质谱分析既可以用于生物大分子的质量分析，例如低聚核苷酸、低聚糖、糖蛋白等；又可以用来生成附加的信息，例如从胰蛋白酶消化液中识别蛋白质、监测生物分子反应的动力学、表征蛋白质的结合和阐明蛋白质更高级的结构等。 ESI-MS的特点 可以和液相色谱、毛细管电泳等现代化的分离手段联用，从而大大扩展了其在生命科学领域的应用范围，包括药物代谢、临床和法医学的应用等 。 相对于MALDI，对于蛋 白的检测灵敏度更高，常可达到飞克级水平以下。 串联质谱 通常, 样本蛋白质先由胰蛋白酶酶解成肽段, 形成多肽混合物。 此混合物送入多维高压液相色谱仪及串联质谱仪, 在一级质谱中进行肽段离子化, 被选离子(母离子)经碰撞诱导解离(collision induced dissociation, CID) 在二级质谱中产生串联质谱。 应用实例 1.通过比较给药前后细胞的蛋白质组,鉴别出毒理学的蛋白质标志物 。 2. 疟疾疫苗的研究。 ICAT技术 同位素标记的亲和标签（isotope-coded affinity tag，ICAT）技术作为一种体外标记稳定同位素的相对定量方法，已经成为重要的蛋白质组学定量分析方案。1999年，Gygi等人用化学方法合成一种能和半胱氨酸反应的亲和试剂，称为稳定同位素编码的亲和标签，它有轻链和重链(稳定重同位素)两种形式，可以在体外标记不同状态下的蛋白质样品，酶解并用亲和柱分离纯化被标记的肽段后，再用质谱进行分析，和体内标记法一样也能够得到成对的峰表示不同样品中肽段及对应蛋白质含量的差异。这种稳定