第07章 高效液相色谱分离技术.B..b..pptVIP

2、应用实例 例1 高效液相吸附（正相）色谱分离皮质甾类化合物 ①分析型：吸附剂：硅胶（粒径0.04mm），玻璃柱的内径2mm、长300mm。洗脱液：甲醇－氯仿，线性梯度，流速1ml/min。检测器：紫外光（240nm）检测。压力：3.4-4.08MPa，样品量：278μg。 皮质甾类混合物的高效液相吸附色谱分离 被分离物质： 1－11－脱氢皮质甾酮 2－皮质甾酮 3－皮质酮 4－皮质醇 Q－脱氧皮质甾酮 S－11－脱氧皮质醇 aldo－醛固酮 ②制备型 分离三个皮质甾体人工混合物 吸附剂：硅胶H（粒度20－50μm）。洗脱剂：二氯甲烷－甲醇（9∶1），流速60ml/min。检测器：紫外光（254nm）检测。压力：1.05MPa。样品量：200mg脱氧皮质甾酮。 制备高压色谱分离皮质甾体 例2 查尔酮和黄烷酮的分离（正相） （说明：粉状吸附剂与薄壳吸附剂效能的差别） 查尔酮和黄烷酮可在酸性或碱催化下相互转换。很难完全转换，两者分离相当困难。 （a） 吸附剂：粉状聚酰胺 淋洗液：甲醇 流速：1ml/min 压力：4.76MPa （b） 吸附剂：薄壳球状聚酰胺 淋洗液：甲醇-水(3∶1) 流速：2.5ml/min 压力：1.22MPa 在聚酰胺柱上分离查尔酮和黄烷酮 可以看出：在（b）的情形下，分离更迅速，给出的峰更尖锐。 例3 青霉素生产中，发酵液成分中，主成分与苯乙酸的含量测定（反相） 为重要的β-内酰胺类抗生素 为有效地控制发酵生产过程，采取对发酵液进行监控，即测定其中主成分与苯乙酸，其方法：HPLC分析。 固定相: LiChrosorb C18 流动相：0.01mol/l醋酸缓冲液(PH4.75)∶乙腈=85∶15 ，流速：1.3ml/min 检测器：紫外检测器，检测波长为254nm 取发酵液样品过滤稀释成300－500万/ml的样品溶液，加入适量苯乙酸标准液，滤膜过滤后进行HPLC分析。见下谱图。 以青霉素钾与苯乙酸为标准物，采用外标法定量，可测定不同发酵时间内发酵液中青霉素与苯乙酸的浓度。 青霉素发酵液样品的HPLC图 1－苯乙酸；2－青霉素 例4 合成莠去津（atrazine）反应中主产物及副产物的HPLC分析 （反相） 莠去津主要用于玉米田除草，其合成是： 反应中有五种副产物存在。所以分析反应混合物组成及含量是十分必要的。产物及五种副产物都含有均三氮苯骨架，但其侧链不同，分子极性及空间体积也不同，因此，在反相HPLC的十八烷基硅烷键合相上有不同的保留值。 固定相: Novapak C18(150×0.4) 流动相: 甲醇∶水＝60∶40 流速：0.7ml/min 紫外检测器波长：254nm 莠去津反应中主产物及副产物的HPLC色谱图 1－三聚氯氰 2－西玛津（2-氯-4,6-二乙氨基均三氮苯） 3－2,4-二氯-6-乙氨基均三氮苯 4－莠去津 5－2,4-二氯-6-异丙氨基均三氮苯 6－扑灭津(2-氯-4,6-二异丙氨基均三氮苯) 例5 糖类分析（离子交换色谱） 色谱条件 色谱柱：Asahipak NH2，250 ? 4.6mm； 进样量：20?l（ppm）； 流动相：乙腈－水，25％乙腈→50%乙腈，15 min 梯度洗脱，流速1.0ml/min； 温度：50℃； 检测器：ELSD（蒸发光散射检测器） F.果糖 G.葡萄糖 L.乳糖 S.蔗糖 R.蜜三糖 St.水苏糖 例6 白曼陀罗中托品类生物碱的测定（IEC） 样品处理 精密称取0.5g白曼陀罗干粉置于50 ml带有玻璃塞的烧瓶内，加10.0 ml氯仿和0.15 ml25％的氨水浸渍过夜。精密吸取2 ml氯仿提取液转移至5 ml容量瓶中，沸水浴中挥发至干。加入1.0ml 内标物溶液（0.2mg/ml盐酸苄胺的甲醇溶液），并用流动相定容至5 ml。 色谱条件 色谱柱：TSK gel 120A 型ODS柱4mm ? 15cm，10?m ；流动相：1/15 mol/L磷酸盐缓冲液(pH=3.50)－甲醇（48∶52），含有17.5 mmol/L十二烷基磺酸钠,1.0ml/min；检测器：UVD（? =210nm）；柱温：35℃。 A.标准品 B.样品 1.樟柳碱 2.山莨菪碱 3.东莨菪碱 4. 盐酸苄胺 5.阿托品 白曼陀罗中托品类生物碱的HPLC谱图 例7 淫羊藿中黄酮类成分的分析（IEC） 样品处理 精密称取生药0.25g，置于50ml带塞三角瓶中，加70％乙醇25ml，称重，超声提取30min，称重并补足损失的溶剂，过滤，弃去初滤液，定量吸取续滤液5 ml，在85℃水浴上蒸干，用甲醇溶液定容至5 ml，进样20?l。 色谱