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蛋白质分离纯化与鉴定—综合性实验 三峡大学医学院生物化学教研室 * * 1、从血清获得高纯度的白蛋白 2、掌握蛋白质盐析、 G-25葡聚糖凝胶层析脱盐、DEAE-纤维素离子交换层析、 SDS电泳的原理与实验操作技术 3、掌握考马斯亮蓝G250染色法定量检测蛋白质的原理和操作方法 4、了解紫外检测仪、自动部分收集器、记录仪、恒压高位槽的原理与使用方法 实验目的 实验流程 蛋白质盐析 葡聚糖凝胶Ｇ-25（脱盐） DEAE-Cellulose离子交换（纯化） 蛋白质浓度检测 SDS电泳法 （鉴定蛋白质纯度） 柱层析实验装置 UV monitor Recorder Fraction Collector Column Buffer Reservoir 柱层析实验 仪器一：HD-3紫外检测仪 波长 光量 灵敏度 电源 调零 根据光吸收原理设计，光源为紫外光，可监测具有紫外吸收物质(蛋白质、核酸、多肽、酶)的检测仪器，与层析柱、部份收集器及记录仪配套，组成一个完整的液相色谱分离分析装置。 构造和功能 1. 检查：连接是否正确，将“波长”旋钮旋到所需波长刻度； 2. 预热：按下 “电源”开关，电源指示灯亮； 3. 调100%：把“灵敏度”旋钮选择到“100％”档，调节“光量”旋钮，数字显示为100，即透光率为100％； 4. 调零：把“灵敏度” 旋到所需档（使用者自行掌握），缓慢调节“调零”旋钮，数字显示为“0”。 备注：以上步骤需反复调节几次。在样品检测过程中，不可再调节“调零”、“光量”旋钮。如绘出的图谱即出峰过小，可改变“灵敏度”选择档，每档成两倍放大关系。 使用方法 柱层析实验 仪器二：BSZ-100自动部份收集器 构造和功能 选择 置数 手/自动 切换 复位 按照设定的时间自动收集样品 使用方法 1. 准备：检查“漏液报警板”、试管插在收集架上； 2. 定位：按“复位”键，“报警”后，再按“复位”键，仪器自动复位；把安全阀上横杆一头的硅胶管对准第一根试管位置，固定好螺钉； 3. 定时：按 “手动/自动”键，仪器为[手动]状态，按“选择”键选定位置，按“置数”键设置时间，再按“选择”键确定； 4. 自动收集：按“切换”键，“收集”指示灯亮，仪器为[收集]状态；按“手动/自动”键，仪器为[自动收集]状态； 5. 停止收集：或按“手/自动”键，仪器为[手动]状态或关电源。 柱层析实验 仪器三：LM17型记录仪 构造和功能 抬/落笔手柄 量程显示 调纸速 纸速启停 纸速显示 电源 量程/零位切换键 当样品流过检测仪时，记录仪即可绘出洗脱图谱 使用方法 1. 打开：按“电源” ； 2. 调零：按“量程/零位” 键，零位指示灯亮，数码管显示“Po”，按[左移]或[右移]键，使记录笔移至所需零位； 3. 选择量程：按“量程/零位” 键，量程指示灯亮，数码管显示当前量程范围，按[增加]或[减少]键，使量程为10mV； 4. 调纸速：按“启/停”键，“纸速显示” 闪烁，按“调速”键调节纸速，确定后按“启/停”键； 5. 记录：取下记录笔的塑料笔套，压下“抬/落笔手柄”； 实验原理一：盐析 盐析salting out 高浓度的中性盐可以中和蛋白质表面电荷、夺取蛋白质周围的水化膜，破坏蛋白质在水溶液中的稳定性，从而将蛋白质从溶液中析出。 常用中性盐：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等 + + + + + + + 水化膜 实验操作一：盐析 0.5ml Serum 0.5ml s(NH4)2SO4 Mix 5000rpm/10min Supernatant Precipitate 上清转至另一Ep管备用； 沉淀＋0.5ml dH2O，离心，留上清液备用。(白蛋白和球蛋白分别留200ul用于电泳上样) 实验原理二：凝胶层析 Sephadex structure (Left: molecule; Right: model) 凝胶过滤gel filtration Table. Physical Characteristics of Polydextran Gels 5,000-800,000 5,000-400,000 4,000-150,000 Fractionation Range(MW) Sephadex G200 Sephadex G150 Sephadex G100 Designation 1,500-30,000 1,000-5,000 700 Fractionation Range(MW) Sephadex G50 Sephadex G25 Sephadex G10 Designation 实验操作二： G-25葡聚糖凝胶层析脱盐 1. 平衡:0.02mol/LNH4Ac缓冲液平衡G-25柱，紫外检测仪、记录仪基线稳定; 2.