第21章 常用分子生物学技术的原理及应用-2011.pptVIP

利用乳腺生产药用蛋白的转基因羊 转入标记基因的转基因猴 八、几种重要的PCR衍生技术 RT-PCR 一、DNA序列分析 1. 化学裂解法 (Maxam ＆Gilbert ,1977 ) 2. 双脱氧链末端终止法 (Sanger ,1977) 3. DNA自动化序列分析 双脱氧链末端终止法（dideoxy chain termination） 以DNA合成 反应为基础。 消减杂交技术的特点: 简便易行,周期短,假阳性低,特异性高,重复性好.对确定基因在疾病发生中的作用具有重要的价值. 基 因 文 库Gene Library 疾病相关基因的克隆与鉴定Cloning and Identification of Disease Relative Genes （三）非定位候选基因克隆策略 由于基因组作图的完成和分子病理学的发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根据病理学变化和对各种基因产物功能的了解，预测出候选致病基因。 第 六 节遗传修饰动物模型的建立及应用 核转移技术 即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆(clone)。 利用乳腺生产药用蛋白的转基因羊 转基因山羊（基因打靶所产生） 四、基因转移和基因剔除技术在医学中的应用 建立动物模型 ① 单基因决定疾病模型 基因剔除 获得性突变(gain-of-function mutation) ② 多基因决定疾病模型 二、基因诊断常用技术方法 甲型血友病的基因诊断（连锁分析1） 三、基因诊断的应用 遗传疾病 肿瘤 感染性疾病，传染性流行病 判断个体疾病易感性 器官移植组织配型 法医学中个体识别、亲子鉴定 五、基因治疗的应用 1.何谓分子杂交?常见的分子杂交的种类有哪些，各检测什么? 2.何谓探针？有什么特点，其作用是什么？ 3.核酸测序的方法有哪两种，其基本原理各是什么？ 4.何谓基因文库？何谓基因组文库、cDNA文库，两者有什么异同点？ 5.基因克隆的策略有哪些，各有什么特点？ 6.何谓基因打靶，常见的基因剔除技术有哪些？ 7.何谓基因芯片、蛋白质芯片，各有什么用途？ 8.研究蛋白质相互作用的酵母双杂交技术的基本原理是什么？ FⅧ基因内含BclI和XbaI多态性位点的两个DNA片段；含?BclI多态性位点的DNA片段在FⅧ基因18外显子内，可产生99bp（碱基对）和43bp。若只产生142bp，说明不具BclI酶切位点的等位基因，与甲型血友病基因连锁；含XbaI多态性位点的DNA片段在FⅧ基因22内含子内，可产生68bp片段，若仅出现一条96bp的区带，说明不具XbaI酶切位点的等位基因，与甲型血友病基因连锁。 PCR/RFLP结合 PCR及其衍生技术 5’ 3’ 引物1 引物2 99 bp 43 bp Bcl I 因子VIII 基因142 bp 片段 PCR-单链构象多态性分析（PCR-SSCP) 将PCR产物变性为单链后进行非变性（中性）聚丙烯酰胺凝胶电泳，单个核苷酸的改变即可造成DNA单链构象的改变，进而导致电泳速率变化，从而检测出基因突变。 1）单链核酸碱基-构象-电泳速率 2）中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 PCR-SSCP分析原理示意 微型化 高通量—提高信息量 平行化—提高信息的可比性 微量化—降低待检样品用量 自动化—提高工作效率 低成本—可迅速普及推广 生物芯片的特征与优点 4. 基因芯片技术 DNA指纹分析用于个体鉴定 癌基因和抑癌基因检测 如原癌基因K-ras第12、13和61位密码子点突变：GGT-TGT/GTT/GAT/GCT； 抑癌基因p53密码子130～290之间的基因突变 正常细胞H-ras基因碱基序列: ATG ACG GAA TAT AAG CTG GTG GTG GTG GGC GCC GGC GGT GTG 肿瘤H-ras碱基序列: ATG ACG GAA TAT AAG CTG GTG GTG GTG GGC GCC GTC GGT GTG 正常细胞p21蛋白的氨基酸序列: Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Ala Val 肿瘤H-ras编码p21蛋白氨基酸序列: Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Ala Val H-ras基因的点突变 蛋白质之间相互作用以及通过相互作