课件：RIZOL法提取总RNA.pptVIP

电泳检测结果： RNA提取： 关键 防止RNA降解 RNA提取的成功与否 是RT-PCR检测中最 重要的步骤。 核酸定量 组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收波长为250~270nm之间。例如腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm，鸟嘌呤：276 nm，胸腺嘧啶：264.5 nm，尿嘧啶：259 nm。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收峰不会改变。但核苷酸最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm，这个物理特性为紫外分光光度法测定核酸溶液浓度提供了基础。 ?在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50ug/ ml；单链DNA或RNA为40ug/ml；单链寡核苷酸为20ug/ml。  DNA样品的浓度为：OD260×核酸稀释倍数× 50/1000（ug/ul） RNA样品的浓度为：OD260×核酸稀释倍数 ×40/1000（ug/ul）??? ??  故根据OD 260 /OD 280的比值可以估计核酸的纯度： DNA样品的比值为1.8， RNA样品的比值为2.0。若DNA样品的比值高于1.8，说明样品中含有RNA污染， 若RNA样品比值高于2.0，则提示RNA 有降解。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低。 实验步骤 取适当体积（2ul）核酸样品，加水或（TE）至100ul，混匀。 将核酸定量仪调制RNA测定一项，输入稀释倍数，然后把样品放入核酸定量仪中读数。核酸定量仪将直接给出样品浓度。 RT-PCR RT-PCR RNA的多聚酶反应（RT-PCR）是以mRNA 为模板进行逆转录反应（reverse transcription， RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的RNA模板。 mRNA cDNA PCR产物 反转录PCR(RT-PCR) mRNA cDNA PCR 特异性引物, Taq酶 Oligo dT, 逆转录酶 用途: 获得所需cDNA片段；检测基因表达 注意问题： 1、PCR效率差异，重复性 2、内参选定 3、mRNA丰度 RNA、缓冲液、dNTP、逆转录酶、 引物（随机引物:Oligo dT) 5’ AAAAAAAA3’ TTTTTTTT mRNA cDNA 1.逆转录： 实验步骤 取1μg总RNA于一PCR管，70℃反应10min，轻轻离心后置于冰上。 2）建立20μl RT反应体系： MgCl2 4μl 10×RT缓冲液 2μl dNTP Mixture（10mM） 2μl（1.25mmol/L） RNase inhibitor 0.5μl 逆转录酶 1μl（200U） Oligo(dT)15引物 1μl 总RNA 1μg 加无核酶水至总体积 20μl 涡旋混匀，42℃反应15分钟，95℃加热5分钟，0-5℃5分钟。 AAAAAAAAAA-3’ TTTTTTTTTT-5’ cDNA rTaq 2.PCR: GAPDH GAPDH GAPDH (sense) GAPDH (antisense) cDNA、缓冲液、dNTP、rTaq、引物（特异引物)、 Mg2+ 实验步骤 建立PCR反应体系： RT获得逆转录反应得到的cDNA 5μl 5.0μM的GAPDH混合引物 2μl 10×PCR buffer 5μl 10mM dNTPs 1μl Taq DNA聚合酶 0.5μl MgCl2 4μl