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* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 从表4-2 还可以发现,氢健突变的△△G值的分布范围比疏水突变的△△G值的分布范围要宽。这是可以预期的。氢键的键能强烈地依赖于氢键的立体几何配置(键长和键角)以及氢键在蛋白质中的位置。除此以外,△△G值还依赖于突变体中被删除的氢键中仍保留着的原子在突变体中的新位置。最有利的情况是这些氢键参与原子在突变体中重新与水分子形成氢健,这时,△△G取决于被删除的氢键数,并给与我们想要的信息。或者,保留着的氢键参与原子形成一个新的分子内氢键,这时△△G=0是所期待的。但是,如果氢键参与原子保持不配对成氢键,那么稳定性会降低许多,因为这个原子在退折叠态会与水形成氢键。后两种情况都很难得到关于氢键被删除时对蛋白质稳定性的影响的信息。 ■二、突变与热稳定性 第三节 突变、稳定性和折叠 3 适应极端条件的突变体 生活在极端自然条件下的生物,它们体内的蛋白质也要适应这些极端的条件。多年来,通过分析具特殊稳定性的蛋白质并用理性设计的方法证实得到的结论,也使蛋白质稳定性获得了实在的增加。这些增加稳定性的方法涉及结构的所有层次。比如,为了增加热稳定性可以作下面的改造:增加疏水 性;改善内部堆积;增长或缩短链套长度;增加被寡聚化掩埋的表面,并使接触面空洞变小和减少;调整二级结构内外的残基;增加脯氨酸;减少热易变残基;增加螺旋含量;增加极性表面积;增加氢键和盐桥。 ■二、突变与热稳定性 第三节 突变、稳定性和折叠 3 适应极端条件的突变体 经过对各种嗜热蛋白质的序列和结构与寻常蛋白质的序列和结构对比研究,发现了一些可以增加蛋白质热稳定性的机制。各种生物在增加热稳定性的方法上各不相同。表 4-3 列出了若干嗜热生物的酶增加热稳定性的机制 。 ■二、突变与热稳定性 第三节 突变、稳定性和折叠 ■二、突变与热稳定性 第三节 突变、稳定性和折叠 However,从对亲极端条件的生物与寻常生物蛋白质的比较分析并不能得到任何一般的结论来说明可以在极端条件下稳定蛋白质结构并保持其生物活性的机制。蛋白质是非常具有个性的对象。每种蛋白质都有自已的方式来增加稳定性和保持活性。所有列出过的机制都可适用于某种蛋白质,但却不能适合于所有蛋白质。这种事实证明,对使得蛋白质能对抗各种干扰而保持稳定性的机制只是一知半解。同时也有必要指出许多热稳定性提高的蛋白质工程突变体确实是通过增加离子对来提高转变温度的 。 ■二、突变与热稳定性 第三节 突变、稳定性和折叠 1 过渡态的突变分析 小的单结构域蛋白质的折叠和退折叠不仅很快,而且是“非此即彼”的两态过程,没有显著布居的半结构中间态。从动理学的角度来看,这种没有中间态的过程可能存在过渡态。过渡态是在从天然态到退折叠态(或从退折叠态到折叠态)的变化过程中分子跨越自由能位垒时的短暂状态,也是转变过程中随时间变化最慢的状态。过渡态的寿命很短,没有直接测定其结构的实验手段,关于过渡态结构的知识只能从折叠动理分析间接得来。 ■三、突变与折叠过程 第三节 突变、稳定性和折叠 1 过渡态的突变分析 用蛋白质工程方法可以研究突变对天然态和过渡态的影响,以发现各位点在折叠中的地位。再与改变折叠条件的方法相结合就可以得到折叠过渡态的更详细的图像。 在这种方法中,通常突变单个的残基。这些突变可以改变天然态、退折叠态和折叠过渡态相互间的能量差。此外,如果折叠过程中还有中间态积累,那么它的能量改变也可以测量出来。于是,突变可以用来报告蛋白质中每一个位点或区域对折叠中各种状态的自由能的影响。 ■三、突变与折叠过程 第三节 突变、稳定性和折叠 1 过渡态的突变分析 当然,作为一个先决条件,当用突变来探测折叠过渡态的结构时,这些突变应该只改变折叠过渡态的相对稳定性,而不改变它的结构。更进一步的假定是,突变并不影响退折叠态。用更严格的语言来说,野生蛋白质的折叠态、过渡态(也许还有中间态)和退折叠态要分别与突变蛋白质的折叠态、过渡态(也许还有中间态)和退折叠态有对应关系,这样才可以比较它们。 ■三、突变与折叠过程 第三节 突变、稳定性和折叠 2 突变对稳定性和折叠过程的影响 稍微小结一下单位点突变可能对蛋白质的稳定性和折叠造成的影响。 ①单位点突变可以在不同程度上影响蛋白质的稳定性。从使稳定性有一定程度的增加,到使稳定性降低,直至使突变体在一般的实验条件下不再有稳定的折叠态,具体产生什么样的影响,除了取决于突变的性质(突变导致的残基侧链大小、几何形状和极性、电离势等化学物理性质上的变化)以外,还取决于突变在三维空间结构中的位置(包括是在核心部位还是在表面
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