生物基础高效液相色谱仪的使用.PPTVIP

一、实 训 目 的 1、了解高效液相色谱仪的构造及工作原理； 2、掌握高效液相色谱仪的使用方法； 3、学会用单点外标法进行数据处理和结果分析。 ——生物工程系 任务五 高效液相色谱仪的使用 了解高效液相色谱法的主要特点及其适用范围 了解高效液相色谱仪的构造 掌握高效液相色谱法的使用技术和定量方法 一、 概 述 高效液相色谱法（HPLC）：以气相色谱为基础，在经典液相色谱（LC）实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。 （一）HPLC的特点 （二）与经典LC相比HPLC的优点 （三）HPLC的适用范围 高压——压力可达150 ～300kg/m2； 高速——流速为0.1～10.0mL/min； 高效——柱效高，在一根柱中同时分离成分可达100种； 高灵敏度——紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。 速度快——通常15～30min一个样，某些样品5min可完成； 分辨率高——可选择固定相和流动相达到最佳分离效果； 灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg； 柱子可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物； 样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏。 适合分析高沸点、热不稳定、离子型的样品 ； 应用范围广泛，适用于医药、环保、石化、生命科学、食品工业、农业等多个领域； 在已知的化合物中能用液相色谱分析的可占70～80%。 一 二、 结 构 高压输液系统 色谱柱系统 （数据记录处理系统）工作站 检测系统 进样系统 动画 1、 高压输液系统 主要部件：贮液器、过滤器、 高压输液泵、梯度淋洗装置 2、进样系统 流路中为高压力工 作状态，通常使用耐高 压的六通阀进样装置。 动画 3、色谱柱系统 柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 4、检测器系统 紫外检测器 荧光检测器 示差折光检测器 光电二极管阵列检测器 5、色谱工作站 以VI2010色谱工作站（软件操作示范）为例：此工作站适用范围广，支持多个检测器：可与任何气相色谱仪、液相色谱仪或带电压输出的电子设备连接，可同时采集一到两个独立检测器信号。 三、 使 用 技 术 准 备 清洗、关机 冲洗柱子冲洗管路关主机 关电脑 关电源 开机、进样 流动相 标液 样液 柱子选择 仪器检查 开电脑、主机、工作站 参数设置 方法建立 进样 1、准备所需的流动相，用合适的0.45μm滤膜过滤，超声脱气20min。 2、根据待检样品的需要更换合适的色谱柱。 3、准备样品和标准溶液，用合适的0.45μm滤膜过滤。 4、检查仪器各部件的电源线、数据线、输液管道是否连接正常。 接通电源，依次开启不间断电源、真空脱气机、多元泵、检测器。待泵和检测器自检结束后，打开电脑显示器，主机、最后打开色谱工作站。 1、参数设定：波长、流速、流动相比例、梯度。 2、更换流动相并排气泡。 3、平衡系统：流动相冲洗系统、检查管路是否漏液、观察压力值变化、观察基线变化。 4、进样：自动进样、手动进样。 1、分析结束，数据处理、打印报告。 2、关闭柱温箱和检测器，然后再用经过滤和脱气的适当溶剂冲洗色谱系统。 3、冲洗完毕后，逐步降低流速至0，关泵。 4、关闭液相装置，作好使用登记，内容包括日期、检品、色谱柱、流动相、柱压、使用小时数、仪器完好状态等。 四、 数 据 分 析 （一）谱图判断 （二）结果分析 分离度——一般应≥1.5； 重复性——两次谱图的峰面积应相差不超过1%； 理论塔板数——应≥规定的理论塔板数目； 拖尾因子——0.95＜T＜1.05； 保留时间——对照与样品的主成分保留时间应大致一致。 1、定性方法 利用已知标准品定性 利用检测器的选择性定性 利用紫外检测器全波长扫描功能定性 2、定量方法 归一化法 外标法 内标法 课后思考题 1、外标法定量与内标法定量有何差别？ 2、流动相在使用前为何要经过脱气处理？ 实训六 高效液相色谱仪的使用 一、 实训目的 二、 实训原理 三、 实训材料 四、 实训步骤 五、 结果分析 六、 注意事项