酶学以及酶工程第四酶提取和分离纯化.pptVIP

第四章 酶的提取与分离纯化;酶的提取、分离纯化技术路线;酶的纯化过程，约可分为三个阶段： (1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均质打破细胞 → 抽出全蛋白，多使用 盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。 (2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化，使用各钟 柱层析法。 (3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳 或 HPLC。;第一节 酶的提取; 一、生物组织的破碎;*;机械破碎;*;破碎率的检测 直接测定法 采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。 如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色； 采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，而受损害的细胞呈亮红色。 目的产物测定法 将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%破碎率所获得的标准数值比较，计算其破碎率。 导电率测定法 细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。导电率随着破碎率的增加而呈线性增加 。 ;二、酶的提取;*;2、酶提取过程的注意事项 pH的选择 ：首先考虑酶的稳定性；其次应远离等电点；一般选择pH4-6为宜。 盐的选择：大多数酶在低浓度的盐溶液中有较大的溶解度，一般选择等渗盐溶液，如0.02-0.05 mol/L的磷酸缓冲液或0.15 mol/L的NaCl等。 温度的选择：一般控制在0-4 0C，如果酶比较稳定可以例外。 抽提液用量：常采用材料量的1-5倍。 其它：加入蛋白酶抑制剂，半胱氨酸或细胞色素C等，来稳定抽提系统。 ;三、酶溶液的絮凝、净化与脱色;絮凝 采用絮凝法可形成粗大的絮凝体，使发酵液较易分离。 絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，包括带电荷的阴离子（如---COOH）或阳离子（如---NH2）基团以及不带电荷的非离子型基团。 它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。 当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架联结时，就形成了较大的絮团，这就是絮凝作用。 ;过滤或离心净化：通过絮凝剂处理后的酶溶液经过离心或过滤将细胞碎片等固性物和杂蛋白，粘多糖，核酸以及脂类等大分子物质去除。 脱色：酶的工业生产中，常用的脱色剂为活性炭，活性炭通过吸附色素而脱色；活性炭用量一般为0.1%-1.5%。 ;第二节 酶的分离;1、盐析(Salting Out)法; 在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。 最常用的是硫酸铵。盐浓度以饱和度表示，饱和盐溶液的饱和度为100%。调整盐浓度有两种方法：加入饱和硫酸铵溶液（蛋白质溶液体积不大时）和直接加入固体硫酸铵（蛋白质溶液体积较大时）。 ?加入饱和硫酸铵：100mL溶液中，由饱和度S1变为S2，应向其中加入的饱和硫酸铵溶液的mL数 V= V0（S1-S2）/（1-S2）。 ?直接加入固体硫酸铵可以直接查“调整硫酸铵溶液饱和度计算表”。;2．等电点沉淀法 两性物质在其等电点时溶解度最低，因此可通过此方法使不同等电点的物质分离 3. 有机溶剂沉淀法（降低介电常数法） 有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20℃时水的介电常数为80，而82％乙醇水溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。 ;*;4．复合沉淀法 在酶液中加入某些物质，使其与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离的方法称为复合沉淀法。 5．选择性变性沉淀法 选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法称为选择性变性沉淀法。 ; 有些多聚电解质可以在极低浓度下选择性地与某些酶结合而形成沉淀。如聚丙烯酸（PAA）可以与某些蛋白酶，溶菌酶和磷酸酯酶等形成沉淀。分离过程如下： PAA+酶 PAA-酶 PAA-酶+Ca 2+ PAA- Ca 2+ + 酶 PAA- Ca 2+ + SO4 2- CaSO4 +