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克隆形成实验 细胞生长状况有关指标的检测方法 一、细胞计数 这是细胞培养中常用的基本技术之一。所用材料为血球计数板，巴氏吸管和显微镜。 细胞计数的基本步骤： (1)取清洁计数板和专用盖玻片，用丝绸布轻轻拭干 . (2)取细胞悬液 0.3mL ，加入 0.9mL 结晶紫 (或台盼至 )染液，混匀后滴半滴于血球计数板内，以充满不外溢 为宜。也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡 . (3)在显微镜下用 10 ×物镜观察计数四角大分格中的细胞数。代入下式得出细胞密度。 细胞数 /ml=(4 大格细胞数之和 /4) ×104 ×稀释倍数 台盼蓝染色法可计算出活细胞数和死细胞数以测定细胞存活百分率。一般 0.5% ～ 1% 的台盼蓝染液可使死 细胞染成蓝色， 活细胞不着色。 此外还可用 0.02% 的藻红 B 染液将死细胞或受损细胞染成红色， 或用 0.05% 的苯胺黑染液将死细胞染成黑色。 细胞存活百分率 = （4 大格活细胞数 /4 大格活细胞 + 死细胞数） ×100% 细胞计数除用上述方法外，目前还有新型的自动计数仪，可供大规模细胞计数工作使用。各种型号的计数 操作不尽相同，可根据使用说明进行操作。 在进行细胞计数操作时，必须把细胞悬液准备好，细胞应分散良好，并充分混匀，若出现较多细胞团或细 胞数少于 200 个 /10mm2 或多于 500 个 /10mm2 时，需重制细胞悬液，重新计数。 二、细胞生长曲线和生长倍数 细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是测定细胞绝对增长数值和生长繁殖基本规律常用的简便 方法。 常用的方法为： 在同一规格的培养瓶中， 接种同等量的同一代细胞，经培养后每隔 24 小时取出几瓶 细胞进行计数，以培养时间为横座标，不同时刻的细胞数的对数为底座标，标出各点并连成线，即为该细 胞的生长曲线，可反应出细胞生长的动态。 测定生长曲线的另一种方法是用 96 孔/24 孔细胞培养板，分 7 组，每组 3 孔，培养一周 (7 天 ) ，期间逐日 检测一组，计数，最后把 7 天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线。 也可采用 MTT 法来进行生长曲线测定，较上述方法简便。 标准的细胞生长曲线近似 “S形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，经过一段时间的潜伏期，再进入对” 数生长期，达到平台期和生长稳定，最后衰老。 细胞生长倍数是指测定接种时活细胞的浓度，经一个生长周期达到最大活细胞浓度的比率。 生长倍数 =培养后最大活细胞浓度 /接种时的活细胞浓度 三、细胞分裂指数 细胞分裂指数是表示细胞增殖旺盛程度的指标。它以被测 1000 个细胞中的分裂细胞数来计算。其方法为： 用秋水仙素将细胞处理 1 ～2 小时后，按染色体制片法制片并染色，计算 1000 个细胞中分裂相的数目，重 复 4 次取平均值，用百分比表示。 基本步骤： (1)细胞准备 用盖片 ( 支持物 )培养法。 (2)每 24 小时取出一个小玻片，按常规方法进行固定，吉姆萨或 HE 染色，封片，制成永久标本。 (3)显微镜下选择细胞密度适中的区域观察分裂细胞并计数。逐个视野进行，对每一时间组的玻片各取细胞 多、中、少 3 个区域各一区，共数 1000 个细胞，计算出平均分裂相值所占百分比。观察时要掌握好分裂 相标准，主要是确定好划分间期和前期，末期和间期等的界限，以减少误差。 细胞分裂指数 =细胞分裂相数 /细胞总数 (1000) ×1000 四、细胞接种存活率 细胞接种存活率又称细胞贴壁率。它是细胞被制成分散的悬液后，以低密度 (2 ～ 5 个细胞 /cm2) 被接种到底 物上，贴壁并能存活生长形成细胞小群 (克隆 ) 的细胞百分数值，用以表示细胞的生存能力和细胞群的活力。 基本步骤： （1 ）取对生长期细胞，用消化法制成细胞悬液，计数后按检测细胞生长曲线的接种细胞的原则，将细胞接 种于培养瓶 ( 浓度相对高些 ) 。接种 12～ 15 瓶。 （2 ）每 2 小时取出一瓶细胞，倒掉