生物物理学的内容.ppt

生色团 条件 ?ex nm ?max 10-3 ?em nm ?F ?F ns 敏感度?max?F 10-2 Trp H2O,pH7 280 5.6 348 0.2 2.6 11 Tyr H2O,pH7 274 1.4 303 0.1 3.6 1.4 Phe H2O,pH7 257 0.2 282 0.04 6.4 0.08 Y-base Yeas t-RNAPhe 320 1.3 460 0.07 6.3 0.91 亚硝基奈酚+Tyr 茚三酮（Cu2+,pH5.8)+Phe ?ex:460nm, ?em:570nm ?ex:365nm, ?em:515nm 四 荧光生色团的结构特点 五 影响荧光测量的因素 1 光化分解（photodissociation） 光照后导致化学键断裂——荧光减弱 2 淬灭(quenching) 温度淬灭： 温度每升高10C ，荧光减少的百分比，称为温度系数。 在20-300C的范围内，温度系数大约为1.5。 浓度淬灭： 21 内滤光效应（inner filter effect) (3)杂质淬灭：3O2 1O2 3 溶液pH的影响 利用一些物质在不同pH值溶液中荧光强度和颜色的改变， 可以判别各种滴定的终点。 指示剂 颜色变化 pH范围 萘 酚 无色变黄绿 8.2-10.3 荧光素 浅绿变绿 4.0-5.0 丫啶橙 浅黄绿变黄 8.0-10.0 4 溶液极性的影响 荧光物质在非极性溶液中的发射峰位比其在极性溶液中的峰位向短波方向 （或高频方向）移动，即蓝移，同时荧光强度前者也高于后者。 DPH 水溶液中 膜 中 发射波长：440nm 发射波长：430nm 5 溶剂和化学试剂 (1) 溶剂选择要适宜 例如：苯、丙酮、酚在紫外波段有吸收。 (2) 溶剂要纯 6 荧光污染 (1) 涂活塞用的润滑油以及橡皮塞和软木塞 (2) 去污剂 (3) 微生物污染 (4) 滤纸 六 荧光分光光度术的应用 (一）.物质的检测 1 测量原理： 稀溶液， F= ? I0εcL 2 结构特点：含有“芳香环”结构 3 灵敏度：10-7~10-8g/ml 检测物质 激发波长nm 发射波长nm 维生素A 345 490 维生素B2，pH7 370 565 维生素B12， pH7 275 305 维生素C 490 530 3,4-苯并芘10-6g/ml 381 403 5羟色胺，中性或弱酸性 295 330 5羟色胺，盐酸 295 550，330 研究生物大分子构象 （二）蛋白质的荧光分析 1 蛋白质的内源荧光 2 蛋白质的外源荧光 （三）核酸的荧光分析 １嘌呤及衍生物 室温，用紫外和可见光照射，中性水溶液中，均无荧光。 　　　　　　　　　　　　　酸性介质中，腺嘌呤和鸟嘌呤有荧光。 　　　　　　　　　　　　　碱性介质中，鸟嘌呤有荧光 ２嘧啶及衍生物 游离的胸腺嘧啶有自发荧光，但量子产率极低Φ＝0.0015 3 核酸的荧光标记 Probes ?ex ?em Note Ethidium Bromide 545 610 非透膜，RNA,DNA Propidium Iodine 530 615 PO-PRO-1 iodine 435 455 Acridine Orange 490 590 透膜，RNA,DNA Pyronin Y 545 580 Bisbenzimide 345 460 透膜，DNA （四） 利用荧光技术检测分子间结合程度 1 用荧光偏振变化检测结合程度 当一些小分子，如辅酶、辅基、半抗原等与特异蛋白质反应时，改变 其荧光特性（强度与偏振），通过这些参数的变化，可以了解他们结 合时的信息。 结合后的大分子驰豫时间长，荧光偏振就大。 用杀鼠灵滴定HSA Scatchard图 r = [L] Ka (n - r) [L] = [L0] – [LP] = [L0] – r[P0] λex=320nm λem=400nm 2 用荧光强度变化检测结合程度 （五） 大分子内基团间或分子间距离的测定 荧光共振能量转移 ( Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET) 荧光共振能量转移的三个条件： 供体和受体都能发光 供体的发射谱和受体的激发谱必须有部分重叠 供体和受体的距离必须小于100? Forster 公式 E=