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Western Blot 实验操作指南 Western Blot 即蛋白质印迹法（免疫印迹试验），是分子生物学、生物化学和免疫遗 传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生 物组织样品中的特定蛋白进行显影。通过分析显影的位置和显影深度获得特定蛋白质在所 分析的细胞或组织中表达情况的信息。 实验流程 主要包括以下几个步骤： 样品制备；SDS凝胶电泳；转膜；封闭；免疫杂交；显影。 实验器材 操作步骤 样品制备 准备进行 western blot 的样品可分为细胞、组织、免疫沉淀或亲和纯化后的蛋白等。样品 为蛋白溶液时不需要进行提取，而样品为细胞、组织或包埋组织等则需要根据样品的特性 对其进行提取。根据需求不同还可针对于细胞亚结构进行提取。 （1 ）以体外培养的贴壁细胞样本为例，对其进行总蛋白提取： 1、 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使 残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 2、 每瓶细胞加 3ml 4℃预冷的 PBS （0.01M pH7.2 ～7.3 ）。平放轻轻摇动1min 洗涤细 胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将 PBS 弃净后把培 养瓶置于冰上。 3、 按 1ml 裂解液加 10 μl PMSF （100mM ），摇匀置于冰上。（PMSF 要摇匀至无结晶 时才可与裂解液混合。） 4、 每瓶细胞加 400 μl 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30min ，为使细胞充分裂解培养 瓶要经常来回摇动。 5、 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎 片和裂解液移至 1.5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） 6、 于 4℃下 12000rpm 离心 5min。（提前开离心机预冷） 7、 将离心后的上清分装转移倒 0.5min 的离心管中放于－20℃保存。 （2 ）以哺乳动物组织样本为例，对其进行总蛋白提取： 1. 将 100 mg 组织剪切成小块，加入适量的冰冷 PBS 洗涤两次后，4℃ ，700×g （3000 rpm) 离心 3 min ，弃上清。20mg 组织加入 100μl 裂解液 ，置玻璃匀浆器冰上均质 30 ～ 50 次。(如使用组织匀浆机，则按照 20 mg 组织加入 100 μl 裂解液的比例加入裂解液。 每个试管加入 2 个直径 2 mm 的磁珠。将试管放入组织匀浆机中，60 HZ ，300s。充分裂 解后，10000 g 离心 5 min ，取上清。) 2. 最大速度涡旋震荡 10sec ，冰上放置20 min ，期间取出震荡3-5 次,再于 4℃ ， 12000 rpm 离心 10 min ，以沉淀组织或细胞碎片，取上清。 生工相关产品： 产品编号 产品名称 产品编号 产品名称 C500005、 细胞核蛋白/浆蛋 C510006、 C510001 RIPA 裂解液 I~IV 白抽提试剂盒 C500007、 C500008 膜蛋白、核蛋白和 动物全蛋白提取试 C510002 胞质蛋白抽提试剂 C510003 剂盒 盒 膜蛋白和胞质蛋白 石蜡包埋组织蛋白 C510005