流式细胞仪细胞分选的操作步骤.docVIP

细 胞 分 选 的 简 要 操 作 步 骤 一、上样前的准备 FACSCalibur可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。 应用无菌技术制备下列无菌工作液。 3L 70% 乙醇（用无菌蒸馏水配制） 5L 无菌蒸馏水 5L 无菌PBS 在干净的鞘液筒中加入3L 70% 乙醇。盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗涤。安好鞘液筒。 将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。。 用70%乙醇冲洗收集管接口处，并喷洒进样口处的空气。 在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管（若不使用浓缩器）。 放上一支装有70 % 乙醇的进样管。 设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。 从Acquire menu选择SortSetup 。在Sort Gate菜单中选择步骤７设定的分选门。按液流控制键RUN。 在Setup方框中打叉，点击Acquisition Control菜单中Acquire。。 跑乙醇直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause，Abort。 再重复上述步骤2次，共需要1h。 断开鞘液筒，在鞘液筒中加入500mL 无菌蒸馏水，振摇鞘液筒，倒掉液体，反复操作直至洗净桶内壁残余乙醇。 在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水，盖紧盖子。安好鞘液筒。 在收集管接口处安装2支新的收集管。 放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。 点击Acquisition Control菜单中Acquire。 跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause，Abort。 再重复上述步骤2次，共需要1h。 断开鞘液筒，在鞘液筒中加入3L 无菌PBS，盖紧盖子。安好鞘液筒。 在收集管接口处安装2支新的收集管。 放上一支装有无菌PBS的进样管。 点击Acquisition Control菜单中Acquire。 第一支收集管（最左）中收集15 mL PBS后取下，使PBS由左至右流入下一收集管。重复操作至2个管都收集了15 mL PBS为止。点击Pause，Abort。 在收集管接口处安装2支新的收集管。若要分选动物细胞，则应用无菌技术，用无菌PBS/4 % BSA缓冲液过夜包被50mL锥型管，将包被好的锥型管安置于收集接口。 按下述分选步骤分选样本。 二、分选细胞 分选前应先做预实验，优化流式细胞仪的测定条件，建立分选门，具体操作步骤见Cellquest操作步骤说明。根据目标细胞的含量，调整流速和样品浓度，使目标细胞通过样品室的浓度为100-300个/秒，最好在200左右。 进入CellQuest，从Aquire菜单连机。 打开CellQuest中存储的获取窗口，打开优化后存储的仪器设置条件。 进样针处放上样本管。 可以先收集一个数据资料，将此数据与用分选后的样本收集的数据比较，以确定分选样本的纯度。 从Acquire menu选择Sort Setup。 依据样本中目的细胞的百分比及实验目的决定分选模式：在Sort Gate中选择分选用的门，如选择No Gate（所有细胞）将只进行获取不分选；在Sort Count-中选择0进行连续分选；在Sort Mode中选择Single Cell、Recovery、Exclusion的某种模式；在Aborted Cell中选择不显示排除细胞数。点ＯＫ。 点击液流控制键RUN。 点击获取控制窗口Aquire。分选结束时点击Pause，Abort。 取下样本管，换上1mL蒸馏水。点击获取控制窗口Standby。 取下收集锥型管。离心浓缩（300g ? 5min），用培养液重悬，按实验所需条件进行培养。 三、上样后的清洗 分选结束后，为保证分选系统管路无腐蚀、无结晶、不堵塞、不染菌，必须进行管路的消毒与清洁，方法如下。且一旦开始进行分选实验后，每周必须开机对分选管路用无菌蒸馏水按照第一部分介绍的方法进行一次充分的冲洗。 应用无菌技术制备下列无菌工作液。 3L 70% 乙醇（用无菌蒸馏水配制） 5L 无菌蒸馏水 在干净的鞘液筒中加入3L 70% 乙醇。盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗涤。安好鞘液筒。 将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。 用70%乙醇冲洗收集管接口处，并喷洒进样口处的空气。 在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管（若不使用浓缩器）。 放上一支装有70 % 乙醇的进样管。 设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。 从Acquire menu选择SortSetup 。在Sort Gate菜单中选择步骤７设定的分选门。按液流控制键RUN。 在Setup方框中打叉，点击Acquisition Control菜单中Acquire。。 跑乙醇直至2支收集管注满（每管注满需要9m