伪狂犬的病毒PCR诊断.pptVIP

② 退火(复性)温度与时间： 退火温度是影响PCR特异性的较重要因素 变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度 对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想 引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T） 复性温度=Tm值-（5～10℃） 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。 复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 ③ 延伸温度与时间： 延伸温度：一般选择在70～75℃之间 常用温度为72℃ 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 3～4kb的靶序列需3～4min 扩增10Kb需延伸至15min 延伸进间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些 循环次数 循环次数 决定PCR扩增程度 循环次数 主要取决于模板DNA的浓度 循环次数：选在30～40次之间 循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多 （6）参数 变性温度与时间