RNA免疫沉淀（RIP）实验方案.PDFVIP

此为临时链接，仅用于预览，将在短期内失效。 RNA 免疫沉淀 (RIP) 实验方案 abcam abcam 2018-08-23 请关注： ↑Abcam 助您更快实现研究使命 查找您进行 RIP 实验所需要的一切，包括一份正确试剂的列表以及实验方案每个步骤的疑 难解答提示。 RIP 是一种基于抗体的技术，用于定位体内的 RNA-蛋白质相互作用。将所关注的 RNA 结合蛋白 (RBP) 与其结合的 RNA 一起进行免疫沉淀，鉴定结合转录RNA（mRNA、非编码 RNA 或病毒 RNA）。可以 通过实时 PCR、微阵列或测序检测。 最近，表观遗传学和 RNA 生物学领域对不同 RNA 作用和功能的关注大大增加。据观察，RNA 的功能 远不止转录和后续的翻译。例如，RNA-蛋白质相互作用能够调控 mRNA 和非编码 RNA 的功能。对 RNA 潜能的这一新认识带动了新方法的发展，使研究人员能够定位 RNA-蛋白质相互作用。RIP 是一种 研究单个蛋白质和 RNA 分子间物理结合的实验方案。 下述 RIP 实验方案修改自 Khalilaet al.(2009)，Hendrickson et al.(2009)，Hendrickson et al.(2008) 和 Rinn et al.(2007)。 实验方案概述 1.收集细胞（使用甲醛选择性处理细胞，体内交联蛋白质-RNA 复合物） 2.分离细胞核，裂解细胞核沉淀 3.染色质片段化 4.将所关注的 RNA 结合蛋白 (RBP) 和结合的 RNA 一起进行免疫沉淀 5.洗去未结合的物质 此为临时链接，仅用于预览，将在短期内失效。 6.纯化免疫沉淀后 RBP 上结合的 RNA 7.将 RNA 逆转录为 cDNA，通过 qPCR、微阵列或测序进行分析 RIP 实验方案 1 细胞收集 1.1.培养细胞至一定密度，按照实验要求进行处理。 1.2.如果需要进行交联步骤，则需要优化固定时间。 查看我们 ChIP 实验方案中的交联部分。 1.3.通过胰蛋白酶消化收集细胞并在 PBS（例如，107 个细胞使用 2 mL PBS）、新鲜制备的细胞核 分离缓冲液 (2 mL) 和水 (6 mL) 中重新悬浮。冰上放置 20 分钟（不时搅拌）。 实验过程中应该保持有一个或多个阴性对照，例如无抗体的样品或敲除细胞或组织的免疫沉淀。不建 议将敲低细胞用于阴性对照实验。 2 细胞核分离和裂解物沉淀 2.1. 2,500 g 离心 15 分钟沉淀细胞核。 2.2. 将细胞核沉淀重新悬浮于新鲜制备的 RIP 缓冲液 (1 mL) 中。 为避免污染，使用不含 RNA 酶的试剂，如不含 RNA 酶的枪头、试管和试剂瓶；同时使用不含 DNA 酶和 RNA 酶的超纯蒸馏水制备缓冲液和溶液。 3 染色质剪切 3.1.将重悬后的细胞核分成两份，每份 500 mL（用于模拟实验和 IP）。 3.2.使用杜恩斯匀浆器捣碎 15 - 20 次对染色质进行机械剪切。 针对不同的细胞系可能需要优化剪切条件。 3.3.13,000 rpm 离心 10 分钟沉淀细胞核膜和碎片。 在液氮中冷冻一份裂解物用于对照 RNA 分离。 4 RNA 免疫沉淀 4.1.将所关注的蛋白质的抗体 (2 - 10 µg) 加入上清液中 (6 - 10 mg)，4 oC 轻柔搅动孵育 2 小时 （至过夜）。 4.2.加入protein A/G 磁珠 (40 µL)，4 oC 轻柔搅动孵育 1 小时。 根据所关注的蛋白质和抗体，加入的抗体量和孵育时间可能需要进行优化。如果一种抗体可以用于 此为临时链接，仅用于预览，将在短期内失效。 IP，则表明它也可能用于RIP。 5 洗去未结合的物质 5.1. 2,500 rpm 离心 30 s 沉淀磁珠，移去上清液，在 500 mL RIP 缓冲液中重悬磁珠 对protein A/G 磁珠沉淀的严格清洗至关重要，并且可能需要优化。 5.2. RIP中重复清洗共三次，随后在 PBS 中清洗一次 第二次清洗后，将5%的磁珠进行冷冻，用于 SDS分析（例如，如果您的磁珠悬浮液总体积为 100 µL，则冷冻 5 µL 的磁珠悬浮液）。 6 对免疫沉淀后 RBP 上结合的 RNA 进行纯化 1.根据制造商的说明，在 TRIzol RNA