Annexin V和PI染色步骤及注意事项.docVIP

磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜内侧，但在细胞凋亡早期，PS可从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面，暴露在细胞外环境中。磷脂酰丝氨酸的转位发生在凋亡早期阶段，先于细胞核的改变、DNA断裂、细胞膜起泡。体内的吞噬细胞可通过识别磷脂酰丝氨酸来清除凋亡细胞。Annexin-V（green）是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合，细胞处于调亡或坏死时，Annexin-V可为阳性（早期坏死细胞可能为阴性），是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测 细胞凋亡的发生。 PI和Annexin-V双标： 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。*注意： 细胞凋亡时其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞标志之一，但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低，或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。 活细胞不能被Annexin V-FITC或PI染色（右图左下象限）。早期凋亡细胞因磷脂酰丝氨酸的暴露及具有完整细胞膜，故呈Annexin V-FITC染色阳性及PI染色阴性（右图右下象限）。坏死或晚期凋亡的细胞呈Annexin V-FITC及PI染色双阳性（右图右上象限）。 *注意：未处理的对照细胞进行常规培养的过程中也有一小部分的细胞死亡发生。 悬浮细胞的染色：Ⅰ、将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5×106）用PBS洗2次，加入200μlBinding Buffer和FITC标记的Annexin-V(20ug/ml)10μl及PI(50ug/ml)5μl,室温避光30min,加入400μlPBS，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1小时），同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。Ⅱ、贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。Ⅲ、爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光显微镜进行观察。结果及注意事项：整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞；操作时注意避光，反应完毕后尽快在一个小时内检测； 注意事项1、必须活细胞检测，不能用能破坏细胞膜完整性的固定剂和穿透剂固定或穿膜。2、特殊细胞的染色方法：在消化或吹打时，有些细胞（如神经元细胞）很容易受到损伤，导致晚期凋亡或坏死比例非常高，不能反映真实结果。实验的解决方法：先低速离心，吸取细胞培养板中的液体，留少许液体，加入适量PI和Annexin-V染色10min后，将漂浮细胞吸至离心管中，离心洗涤两次，用PBS漂洗贴壁细胞两次，加胰酶消化后将细胞悬液移至另一离心管中，离心洗涤，再与漂浮细胞合并后上流式细胞仪检测。应用该法可降低晚期凋亡和坏死比例，增加早期凋亡细胞比例。3、由于Annexin-V为钙离子依赖的磷脂结合蛋白，只有在钙离子存在的情况下与PS的亲和力才大，因而在消化细胞时，建议一般不采用含EDTA的消化液。4、必须设置阴性对照和补偿对照（分别单染）。