cck8实验方法_MCE.docVIP

　　Cell Counting Kit-8，简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度、无放射性的比色检测试剂盒。CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中，不需要预配各种成分。WST-8在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅(生成的formazan量)和细胞数目呈线性关系 　　操作说明 　　本试剂盒可以用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测。 　　1.制作标准曲线 　　a.先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞； 　　b.按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做5-7个细胞浓度梯度，每组4-6个复孔； 　　c.接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后每100μL培养基加10μL CCK-8试剂培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标，OD值为纵坐标的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量。使用此标准曲线的前提条件是试验条件完全一致。 　　2.细胞活性检测 　　a.在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)，将培养板放在培养箱中预培养24小时； 　　b.向每孔加入10μL的CCK-8溶液(注意不要产生气泡)； 　　c.将培养板置于培养箱内孵育1-4小时； 　　d.用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。 　　3.细胞增殖-毒性检测 　　a.在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)，将培养板放在培养箱中预培养24小时； 　　b.向培养板加入不同浓度的待测药物； 　　c.将培养板在培养箱孵育一段适当的时间； 　　d.向每孔加入10μL的CCK-8溶液(注意不要产生气泡)； 　　e.将培养板置于培养箱内孵育1-4小时； 　　f.用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。 　　保存条件 　　4°C一年 　　-20°C两年 　　长期保存，建议避光 　　注意事项 　　1.CCK-8的培养时间一般为1-4小时，但在培养30分钟左右即可取出肉眼观察显色程度，根据细胞种类而定，需要摸索条件，CCK-8的*佳反应时间以具体显色的*佳时间为准。 　　2.使用96孔板进行检测时，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发问题。一方面，由于96孔板周围一圈*容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加相同量的PBS、水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。 　　3.本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，所以还原剂(例如一些抗氧化剂)会干扰检测，如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定。 　　4.加入药物中如含有金属，对CCK-8显色有影响。终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是10 mM的话，将会100%抑制。 　　5.培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。 　　6.本产品可以检测，但不能检测酵母细胞。向100μL培养液中加入10μL CCK-8溶液，并培养1-4小时或过夜。 　　7.CCK-8试剂对细胞的毒性非常低。它和活细胞内的脱氢酶持续反应使溶液颜色不断加深，OD值不断增加(注:活细胞内的脱氢酶是持续产生的)。 　　8.要测定细胞的具体数量，建议同时做标准曲线。 　　9.建议采用多通道移液器，以减小平行孔间的差异。 　　10.以下方法可以终止CCK-8反应(96孔板)： 　　(a).在显色反应后，将培养板放置4°C冰箱内 　　(b).每孔加10μL 0.1 M HCl溶液 　　(c).每孔加10μL 1%(w/v)的SDS(十二烷基硫酸钠)溶液 　　注意：反应停止后，应在24小时内测定。 　　11.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。 　　12.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。