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中性蛋白酶活性测定试剂盒使用说明 分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号：BC2290 规格：50T/24S 产品内容： 试剂一：液体×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加 10 mL蒸馏水溶解。 试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入 10 mL试剂一，沸水溶解。 试剂四：粉剂×1瓶， 4℃保存。临用前加50 mL蒸馏水溶解。 试剂五：液体×1瓶，4℃保存。 标准品：液体×1支，0.25 μmol/mL标准酪氨酸溶液，4℃保存。 自备仪器和用品： 可见分光光度计、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿、1.5 mL EP管和 蒸馏水。 产品说明： NP在一定的温度和中性pH条件下，催化水解蛋白质。由于其安全无毒、水解能力强、作用 范围广等特点，中性蛋白酶常用于食品、饲料、化妆品和营养保健品生产。 中性条件下，NP催化酪蛋白水解产生酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生 成钨蓝；在680nm有特征吸收峰。 操作过程： 一、粗酶液提取： 1. 组织：按照组织质量 （g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例 （建议称取约0.1g组织， 加入 1mL试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即粗酶液。 2. 血清或培养液：直接测定。 3. 细菌、真菌：按照细胞数量 （104个）：试剂一体积 （mL）为500~1000：1的比例 （建议 500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞 （功率300w，超声3秒，间隔7秒，总 时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 二、测定操作： 1.分光光度计预热30min，调节波长到680 nm，蒸馏水调零。 2.试剂二、试剂三和试剂四置于30℃水浴保温30min。 3. 对照管：取一支EP管，加入100μL粗酶液，200μL试剂二，混匀后置于30℃水浴保温 10min；加入200μL试剂三，混匀后8000g， 4℃离心10min；取200μL上清液，加入新的 EP管，再加入 1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm 测定光吸收，记为A对照管。 4. 测定管：取一支EP管，加入100μL粗酶液，200μL试剂三，混匀后置于30℃水浴保温 10min；加入200μL试剂二，混匀后8000g， 4℃离心10min；取200μL上清液，加入新的 EP管，再加入 1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm 测定光吸收，记为A测定管。（注意与空白管不同，先加试剂三，后加试剂二） 5. 空白管：取EP管，加入200μL蒸馏水，1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于 30℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A空白管。 6. 标准管：取EP管，加入200μL标准品，1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于 30℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A标准管。 注意：空白管和标准管只需 要测定一次。 三、计算公式： 1. 按照样本蛋白浓度计算 NP活性单位定义：30℃每毫克蛋白每分钟水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。 NP活性 （nmol/min /mg prot） C标准品× （A测定管－A对照管）÷ （A标准管－A空白 管）×稀释倍数÷ （Cpr×V1）÷T 625× （A测定管－A对照管）÷ （A标准管－A空白管） ÷CprC标准品：0.25 μmol/mL标准酪氨酸溶液；稀释倍数：（100+200+200）÷200 2.5； Cpr：粗酶液蛋白质浓度 （mg/mL），注意该粗酶液不能直接用于蛋白质含量测定，需要另外 测定；建议称取同样质量的样品，加入1mL蒸馏水匀浆提取离心后，用本公司蛋白质含量测 定试剂盒测定；V1：加入反应体系中粗酶液体积 （mL），100μL 0.1 mL；T：催化反应时间