实验四、多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质.docx

实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶（ PPO）活性测定及酶学性 质 一、 实验目的 掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。 了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。 二、 实验原理 马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观 品质和营养价值大为降低， 制约着马铃薯的开发利用。 酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。 其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。 多酚氧化酶 (polyphenol oxidase，PPO)又称酪氨酸酶、 儿茶酚酶、酚酶等．是 自然界中分布极广的一种含铜氧化酶．普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。植物受到机械损伤和病菌侵染后， PPO 催化酚与 O2 氧化形成醌，使组织形成褐变．以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。 因此，检测食品中多酚氧化酶具有重 要意义。 多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、 pH 条件下，有氧存在时， 能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在 410nm 处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计 410nm 处使反应体系的 OD 值产生变 化，通过 OD 值的变化确定 PPO 的酶活大小。多酚氧化酶 邻苯二酚（儿茶酚）＋ 1∕ 2 O2 ——————→ 邻醌 ＋ H2O 三、 试验材料、试剂及试验用品 1．材料：马铃薯块茎。 2．仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶 3．试剂： 0.1mmol/L 磷酸缓冲液（ pH=7.0）；0.01mol/L 邻苯二酚； 0.1mol/L 磷酸氢二钠； 0.1mol/L 磷酸二氢钠； 10mmol/L 柠檬酸； 10mmol/L 抗坏血酸； 10mmol/L 乙二胺四乙酸二钠（ EDTA ）； 10mmol/L 亚硫酸钠 四、 实验方法： 1.多酚氧化酶的提取 0.5g 马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（ pH7.0）3ml ，研磨匀浆，转移到离心管中，再用 7mL 磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在４℃下离心 8000r/min）5min，取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。 2.多酚氧化酶活性测定 采用比色法测定。将 0.5ｍl 邻苯二酚加入 2ｍl 磷酸缓冲液（ｐＨ 7.0）中，加入 0.5ｍl 酶提取液，立即于波长 410nm 下测定吸光值， 2min 后再计吸光值，以不加酶提取液的反应液做对照 (注意空白为： 2.5 ml 缓冲液和 0.5 mL 邻苯二酚 溶液 )。以每分钟吸光度变化 0.01 为 1 个多酚氧化酶活性单位。 表 1 多酚氧化酶活性测定 空白组 试验组  磷酸缓冲 液（ mL ） 2.5 2.0  邻苯二 粗酶液 酚（mL ） （ mL） 0.5 0 0.5 0.5  OD410  2min 后 OD410  △ OD410  酶活力 （ U） 3.多酚氧化酶酶活的计算公式： 以每克样每分钟内 A410 增加 0.01 为 1 个酶活力单位 U。 △A410×酶提取液总量（ ml） 酶活力（0.01A/g min ）＝ ————————————————— — — 0.01 ×反应时间 (min) ×样品鲜重 (g) ×测定时酶液用量 (ml) 酶学特性 4.1 PH 对多酚氧化酶活性的影响 室温下在试管中加入已配好的不同 pH 值的缓冲溶液 2.0mL ，邻苯二酚 0.5ml，多酚氧化酶粗酶液 0.5 mL，混匀后迅速测定吸光度，转换为多酚氧化酶 的活性。以缓冲液 pH 值为横坐标，多酚氧化酶活性为纵坐标，作出酶活 —pH 曲线，以确定最适 pH 值。 表 2 pH 对多酚氧化酶活性的影响 组 不同 pH 的磷酸 邻苯二 粗酶液 OD410 2min 后 △OD410 酶活力 号 缓冲液（ mL ） 酚（mL ） （mL ） OD410 （U） 1 pH=4， 2.0mL 0.5 0.5 2 pH=5， 2.0mL 0.5 0.5 3 pH=6， 2.0mL 0.5 0.5 4 pH=7， 2.0mL 0.5 0.5 5 pH=8， 2.0mL 0.5 0.5 4.2 温度对多酚氧化酶活性的影响 试管中加入 pH 7.0 的磷酸盐缓冲溶液 2.0mL, 以邻苯二酚溶液 0.5mL 为底物 , 在不同温度（常温、 40、 60℃的温度条件 )下保温 5min 后，加入多酚氧化酶粗酶 0.5mL，混匀后在室温下测定多酚氧化酶的活性。以温度为横坐标，多酚氧化酶活性为纵坐标，作出酶活 —温度曲线，以确定最适温度。 表 3 温度对多酚氧化酶活性的影响 温度 磷