蛋白质类药物分析报告.ppt

人胰岛素 赖脯胰岛素 谷赖胰岛素 门冬胰岛素 甘精胰岛素 地神胰岛素 4、检查 纯度：经高效液相色谱（SEC-HPLC）和SDS检测，纯度大于99.0%。 有关物质：照效价测定项下的方法记录色谱图，按面积归一化法计算，总有关物质不得过3.0％。 高分子蛋白质：照高效液相色谱法(附录ⅤD)测定，以胰岛素单体-二聚体为对照品，以人胰岛素单体和二聚体之间的峰谷高与二聚体峰高之比作为分离度，供试品溶液色谱图中显示的所有分子量大于重组人胰岛素单体的各峰面积之和，应不得大于对照溶液主峰的峰面积(1.0％)。 细菌内毒素：依(附录Ⅺ E)采用鲎试剂法检查，每1mg重组人胰岛素中含内毒素的量应小于10EU。 宿主细胞蛋白：采用ELISA法测定，每1mg重组人胰岛素中宿主细胞蛋白不得超过10ng。 宿主细胞DNA:采用定量PCR法测定，每剂量重组人胰岛素中宿主DNA不得超过10ng 卡那霉素：采用ELISA法测定，重组人胰岛素中卡那霉素不得超过10PPM。 锌：照分光光度法（附录Ⅳ A），在620nm的波长处分别测定吸收度，计算。含锌量不得过1.0％。 氯：照氮测定法（附录Ⅶ D 第二法）测定，按干燥品计算，含氮量应为14.5％～16.5％。 知识回顾Knowledge Review * 白喉CRM197蛋白 酸水解 LysCby（酶解） * 过甲酸 * MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱, 英文名Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry）MALDI-TOF的准确度高达0.1%~0.01%，远远高于目前常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术，目前可测定生物大分子的分子量高达600KDa。 * 鼠主要碱性蛋白(MBP)细胞色素b DM 二硫化二苯并噻唑? * 金黄色葡萄球菌蛋白酶 蛋白酶V8 蛋白内切酶GluC * TSKgel SuperSW3000 TSKgel G3000SWXL TSKgel?SW系列色谱柱是一类硅胶型尺寸排阻色谱填料，孔径分布适合于蛋白质的分离，  * UHPLC是超高效液相色谱仪的简称，其英文全称为Ultra High Performance Liquid Chromatography。UT-rEX?(UHPLC refractometer with EXtended range) UHPLC折射计的扩展范围；UVD和RID是色谱仪的检测器，是色谱仪的一部分。例如你的样品在紫外有吸收，就可以选择紫外检测器。如果在紫外没有吸收，那就可以选择RID，示差检测器。 * Coomassie brilliant blue?G250 * 四、含量测定（Chp附录ⅥD） 目的主要用于原液比活性计算和成品规格的控制 采用Folin-酚试剂法(Lowry法)、染色法(Bradford法)、双缩脲法、紫外吸收法和HPLC法等方法，其中Lowry法和Bradford法是在质量检定中经常使用的方法 1、Folin-酚试剂法(Lowry法) 原理：在碱性溶液中蛋白质肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，该蓝色化合物在650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比 用于微量蛋白质的含量测定，灵敏范围：5～100μg/ml 优点：方法简便，灵敏度较高；所用仪器简单，不同T间的变异少，需时约40min，优先采用 缺点：Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此蛋白质中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用；不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同 2、Bradford法 原理：考马斯亮蓝G-250（CBB G-250，λmax=488nm）与蛋白质结合后形成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收峰，且蓝色深浅与蛋白质浓度成正比。国外已将重组制品将Bradford法作为样品含量常规检定方法 灵敏范围：25～200μg/ml；0.1ml的最小体积可测得的最低蛋白质为2.5μg 优点：试剂配制简单，操作简便快捷；迅速（2min）；敏感（较Lowry法高4倍）；结合物在室温下1h内保持稳定；所需蛋白质量少（微克级）；干扰物质少等优点 缺点：较高浓度SDS、Triton X-100等对其有干扰；不同的纯化蛋白质间有可变性 3、BCA法 原理：在碱性的条件下，蛋白质与Cu2+络合，并将其还原Cu1+；Cu1+和BCA（bicinchoninic acid，二辛可酸）试剂反应，使其由原来的苹果绿形成稳定的紫蓝色复合物，该水溶性复合物在562nm处有强烈的光吸收，吸光度和蛋白质浓度在广泛范围内有良好的线性关系 定量范围：2