重叠延伸PCR克隆拟南芥Accase基因和植物表达-中国油料作物学报.pdf

２００９年１２月 中国油料作物学报 ２００９，３１（４）：４０７－４１２ Ｃｈｉｎｅｓｅｊｏｕｒｎａｌｏｆｏｉｌｃｒｏｐｓｃｉｅｎｃｅｓ 重叠延伸ＰＣＲ克隆拟南芥ＡＣＣａｓｅ 基因和植物表达载体构建 胡亚平，夏玉平，吴　刚，武玉花，肖　玲，李　均，卢长明 （中国农业科学院油料作物研究所，农业部油料作物生物学重点开放实验室，湖北 武汉４３００６２） 　　摘要：植物的乙酰辅酶Ａ羧化酶（ＡＣＣａｓｅ）催化乙酰辅酶Ａ羧化生成丙二酸单酰辅酶Ａ，是脂肪酸合成的第一 步，该步骤是种子脂肪酸合成与含油量形成的关键调控步骤。拟南芥中的真核形式ＡＣＣａｓｅ基因ｃＤＮＡ长约７０００ ｂｐ，难以直接克隆。本研究先通过常规ＰＣＲ将其ｃＤＮＡ分成八个重叠的片段分别扩增出来，再用重叠延伸ＰＣＲ将 得到的片段逐步拼接成长度为６８９０ｂｐ的完整的基因序列，测序证实克隆序列正确无误，最后将其克隆到农杆菌转 化植物的载体上。序列分析发现ＡＣＣａｓｅ基因的开放阅读框长度为６７６５ｂｐ，编码一个含２２５４个氨基酸残基的多 肽链，推测其