第11章、定量分析技术.pptxVIP

第三部分 鉴定技术;第11章、定量分析技术;物理性质：紫外吸收法 化学性质：Folin－酚试剂法（Lowry法），BCA法（Bicinchoninic acid 法），凯氏定氮法，双缩脲法（Biuret法），胶体金测定法，等等 染色性质：考马斯亮蓝染色法（Bradford法）、银染法 测定绝对含量应用凯氏定氮法（蛋白质的含氮量为16％）。; 蛋白质在紫外光区（190nm-360nm）有两个强烈吸收峰：280nm和190nm。 ;;280 nm光吸收法： 根据吸光值或蛋白质摩尔消光系数ε的文献值，可直接计算出样品溶液中蛋白质的浓度。 如果已知某一蛋白质在280 nm处的摩尔消光系数(ε) ，测定蛋白质溶液280 nm吸光值后，根据公式：c =A/ε，可直接计算出蛋白质浓度。;280 nm和260 nm吸收差法： 若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的核酸类物质，用280nm来测定蛋白质浓度时，会有较大的干扰。由于核酸在210 nm的光吸收比280 nm强，因此可利用280 nm及260nm的吸光值之差来计算蛋白质的浓度。常用下列经验式估算： 蛋白质浓度=1.45 A280nm - 0.74 A260nm (mg/mL) 假设1 mg/mL蛋白质溶液的A280nm为1。;215 nm和225 nm的吸收差法: 蛋白质的肽键在200-250 nm有强的紫外线吸收。其光吸收强弱在一定范围内与浓度成正比，且波长越短，光吸收越强。若选取215 nm可减少干扰及光散射，用215 nm和225 nm吸光值之差与单一波长测定相比，可减少非蛋白质成分引起的误差。因此，对稀溶液中蛋白质浓度的测定可用215 nm和225 nm光吸收差法。常用下列经验式估算： 蛋白质浓度=0.144（A215nm - 0.74 A225nm） (mg/mL);优点： 不需添加任何试剂，因而对样品没有任何破坏； 测量极其简单迅速； 蛋白浓度和吸光度是线性关系，容易计算。 适合测试纯度较高、成分相对单一的蛋白质。 ;缺点： 干扰测定的影响因素多，尤其是RNA和DNA在此波长均有强吸收, 所以一定要考虑样品中是否有核酸。要得到准确可靠的结果，必须严格控制样品溶液的pH和化学组成，使待测样品和标准样品的实验条件一致。 敏感度低，要求样品的浓度较高，量较大。 用标准曲线法测定蛋白质含量时，对于那些与标准蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，误差较大。 ;蛋白质定量方法的改进; Lowry 法的改进法。 碱性条件下，蛋白分子中的肽键与Cu2+形成络合物，并将Cu2+还原成Cu+；Cu+与BCA结合成紫色复合物，在562nm处吸收值与浓度呈正比。;与Lowry方法相比，BCA法的操作更简单，试剂更加稳定，灵敏度更高（微量检测可达到0.5μg/ml），应用更加灵活。 可耐受高达5%的表面活性剂。;原理：该方法由Bradford于1976年建立。在酸性条件下，考马斯亮蓝与蛋白质结合后最大光吸收波长由465nm（红色）转移为595nm（蓝色），起作用的主要氨基酸是Arg，另外，His, Lys, Tyr, Trp和Phe也有作用。 2－5min呈最大光吸收，至少可稳定1小时;简便, 迅速，灵敏度较高。只需要一种反应试剂 影响因素较少。去污剂和两性物质对测定有干扰 小于3000Da 的多肽无法测定 蛋白浓度高时非线性 配制的染色液需过滤除去未溶解的考马斯亮蓝G250;实验操作步骤 ;四、如何选择合适的蛋白定量方法？;;注意事项;■ 不同蛋白质的定量差异：