病毒与宿主蛋白质相互作用.docVIP

病毒与宿主蛋白质相互作用 关键词：细胞 atcc细胞库 标准物质 北京标准物质网 \o 奶粉中蛋白质标准物质 蛋白质是 \o 全血细胞溶液标准物质 细胞执行生命活动的关键物质，起到调控代谢、信号转导、物质运输、构成 \o 全血细胞溶液标准物质 细胞结构等作用。在病毒感染的生命周期中，普遍存在病毒与宿主蛋白之间的相互作用。例如HIV-1感染细胞后，人们已经通过实验证实了上千例病毒蛋白与宿主蛋白之间具有功能性的相互作用事件。通过病毒一宿主蛋白质的相互作用完成病毒与宿主之间的通话。因此要破解病毒与宿主之间的复杂相互作用，就需要研究病毒与宿主蛋白质相互作用。虽然已经通过实验手段鉴定并深入研究了很多病毒与宿主蛋白之间的相互作用，然而全面并且准确地对病毒一宿主蛋白相互作用的鉴定工作目前还远未完成。 许多实验手段被广泛应用于检测病毒和宿主蛋白之间的相互作用。根据一次实验能够检测的相互作用蛋白质的数量，这些技术手段可以大致分为小规模和大规模鉴定实验。 1.小规模蛋白质-蛋白质相互作用实验? 小规模实验中，被检测的蛋白有一定的目的性，通常是由前期的实验或假设决定。此时同时检测的蛋白质小于十个，不同于高通量筛选。小规模实验具有劳动密集型和费时的特点。涉及的技术包括生物化学、遗传学以及生物物理学的方法。现将常用的分析蛋白质相互作用的方法列举如下：免疫共沉淀：利用抗原抗体反应将待检测蛋白与目的蛋白共同沉淀到固相，然后通过Western blot等方法进一步检测。免疫共沉淀技术既能够检测转染蛋白的相互作用，也能检测 \o 全血细胞溶液标准物质 细胞内源蛋白质间的相互作用。 pulldowll：与免疫共沉淀类似。原理是把靶蛋白通过亲和标签固定在固相载体上作为诱饵，然后与含有待测蛋白的细胞裂解液或纯化产物进行共孵育。如果有相互作用，猎物蛋白将被捕获，通过Westem blot等方法检测。与免疫共沉淀技术相比，pulldown实验能够确认诱饵蛋白和猎物蛋白之间的直接相互作用。图6-7-6为GST-pull down的示意图，大肠埃希菌中表达GST融合蛋白作为诱饵，TNT系统中表达猎物蛋白，进行pull-down检测。 荧光共振能量转移：两个蛋白融合不同荧光标签并在同一细胞中表达。荧光共振能量转移是指两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团(供体)的发射光谱与另一个基团(受体)的吸收光谱有一定重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时(一般小于10nm)，会发生能量由供体荧光标签向受体标签转移的现象。能量转移时可观测到供体荧光标签发射光的衰减和受体标签发射光的增强(图6-7-7)。 X线晶体衍射：将相互作用的蛋白共结晶，通过X线衍射技术从原子水平分析蛋白质的相互作用。 2.大规模蛋白质一蛋白质相互作用实验? 具有高通量的特点，但是假阳性和假阴性情况比较常见。鉴定到的相互作用需要通过小规模实验做进一步验证。酵母双杂交是大规模蛋白质相互作用鉴定的常用方法。其基本原理是：酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的，往往由两个或两个阻上结构上分开、功能上相互独立的结构域构成，其中有DNA结合功能域和转录激活结构域。这两个结构域分开时不能激活转录，只有二者在空间上较为接近时才能重新呈现转录因子活性。因此在酵母双杂交系统中，诱饵蛋白与DNA结合结构域融合，其他猎物蛋白与转录激活结构域融合。当诱饵与猎物蛋白质发生相互作用，DNA结合结构域和转录激活结构域互相接近恢复转录因子的活性，从而激活报告基因的表达。尽管酵母双杂交系统被广泛应用到筛选与目的蛋白相互作用的蛋白质实验中，并被用来筛选与病毒蛋白相互作用的宿主蛋白，但是高的假阳性和假阴性率以及不同实验室间的重复率差异仍然是无法避免的。 亲和纯化，质谱法也是鉴定新的相互作用的有力手段。大致的方法是首先通过亲和层析分离含有目的蛋白的蛋白质复合物，然后通过质谱分析鉴定这些相互作用的蛋白。常用的亲和层析方法包括：利用目的蛋白的特异性抗体进行免疫共沉淀，或者通过目的蛋白融合的标签蛋白进行免疫共沉淀；利用目的蛋白融合的GST标签进行GST-pull down等。与酵母双杂交相比，亲和纯化，质谱法可以检测蛋白质复合物中与目的蛋白相互作用的蛋白，不需要两个蛋白必须存在直接相互作用。