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病毒复制适应性系统的建立 关键词：病毒 细菌 细胞 同位素 氨基酸 化学试剂 标准溶液 北京标准物质网 关于 \o 乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）冻干标准物质 病毒适应性的研究是最近病毒学研究的一个热门领域，涉及灵长类、脊椎动物、无脊椎动物、植物和 \o 细菌内毒素工作标准品（盒） 细菌病毒。许多研究报道了与人类感染性疾病相关的RNA \o 乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）冻干标准物质 病毒，例如 \o 人类免疫缺陷病毒-1型核酸（HIV-1RNA）血清（液体）标准物质 HIV-1， \o 甲型H1N1流感病毒核酸国家参考品 流感病毒以及登革热病毒等。对RNA病毒的研究包括药物耐受，免疫逃避，突变效应，准种多样性等。在病毒适应性领域的研究中，常用病毒突变体在宿主个体或者培养的 \o 全血细胞溶液标准物质 细胞中的复制情况来评价 \o 乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）冻干标准物质 病毒的复制适应性。在此主要介绍几种研究 \o 乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）冻干标准物质 病毒复制适应性的系统。 近年来，人们之所以倾向于研究病毒的复制适应性，其主要原因可能是其最容易在实验室中进行。典型的复制适应性研究是比较来自于同一病毒株的各个突变体之间的复制能力。最常用的分析实验包括平行感染实验和生长竞争实验。两者之间的差别如图6-7-8所示。 生长竞争实验在检测 \o 乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）冻干标准物质 病毒复制适应性方面要优于平行感染实验。其原因主要有以下几个方面： 第一，在生长竞争实验中待测 \o 乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）冻干标准物质 病毒的复制和标准病毒的复制是在相同条件下比较的，这就排除了在平行感染实验中可能出现的由于培养条件的差异而导致的潜在的人为因素。如果待测病毒有更低的复制适应性，那么在生长竞争实验中，待测病毒的生长优势相对于标准病毒来说将会逐渐下降。 第二，如果将待测病毒与 \o 土壤成分分析标准物质-黄红壤 标准病毒相对比例在感染后多个时间点进行比较，那么生长竞争分析对于病毒接种量来说相对不敏感，这是相对于平行感染实验的另一个显著优势。 第三，生长竞争实验能够发现在复制适应性方面较小的差异，而这些差异在平行感染实验中有时会检测不到。然而生长竞争实验需要定量分析区分待测病毒与 \o 土壤成分分析标准物质-黄红壤 标准病毒，这样通常会大大增加分析的复杂性以及费用。除此之外，在生长竞争实验中，可能会出现病毒重组的问题，如果重组的子代病毒在遗传上多个位点不同于标准病毒，那么就可能会改变待测病毒的复制适应性检测，因此生长竞争实验需要严格的质控，防止 \o 乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）冻干标准物质 病毒之间重组发生。 用于测量病毒复制适应性 \o 定量分析 定量分析的方法有很多。传统的定量方法是菌斑形成单位(PFU)。最近人们可以通过测量病毒DNA、RNA或者蛋白水平来进行病毒定量。这些指标可以通过定量PCR、异源双链示踪检测法(heteroduplex tracking assay，HTA)、ELISA、荧光探针 \o 同位素标记三聚氰胺-15N3(取代位置在NH2上)标准品 标记和子代测序等技术来获得。这些分子相关技术不仅可以估计病毒载量，而且可以进行高通量分析，具有更高的灵敏度，还可以在混合感染中用于区别病毒的基因型。然而它们不能像PFU那样用来定量具有感染性的病毒。此外，HTA需放射性 \o 炭黑中碳同位素标准物质 同位素 \o 食品检测用亚硝酸钠溶液标准物质 检测，昂贵、费时；定量PCR批量间差异比较大，重复性相对较差；而且这些分子技术常需要提取感染宿主 \o 全血细胞溶液标准物质 细胞基因组，之后对其进行相应目的基因的检测。 为了克服上述一些检测方法的缺陷，近年来有人建立了新型荧光重组病毒竞争实验体系。该实验体系将待测病毒与标准病毒分别以不同的荧光蛋白标记，构建荧光重组病毒。具体过程如图6-7-9所示。在该系统中，两种携有不同荧光蛋白的竞争病毒分别单独感染及共感染靶 \o 全血细胞溶液标准物质 细胞。单独感染的两种不同病毒分别作为两种竞争病毒的自身对照，不同的荧光蛋白作为区分两种竞争病毒的标签，通过流式细胞技术分别计算带有不同荧光的细胞个数可以快速准确地获得不同病毒感染的细胞数量。经过相应的计算可以得到两种竞争病毒的相对适应性(relative fitness)。 对于一种病毒来说，其基因组的不同区域对于复制适应性的影响不同。如今随着分子生物学的快速发展，快速DNA序列测定及PCR的广泛应用，人们得以获得大量核苷酸序列数据。通过对不同毒株的序列进行分析，能够使人们清楚地了解它们之间的遗传学关系，同时我们也可以对影响病毒复制适应性的基因组区域进行进化分