高致病性PRRSV WUH3株分离鉴定及体外传代的遗传变异研究.docxVIP

高致病性PRRSV 高致病性PRRSV WUH3株分离鉴定及体外传代的遗传变异研究 摘要 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的 一种传染病，以妊娠母猪繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状引起高死亡率为特征。早 在1987年该病在美国南部被报道，随后遍及世界各地，给全球养猪业造成了巨大的 经济损失。 2006年，我国暴发了一种“猪高热综合症，以高发病率、高热和高死亡率为 特征。研究者通过很多研究，证实高致病性PRRSV变异株是“猪高热综合症”的 主要病原。针对这种新的PRRSV，本研究进行了病毒的分离与鉴定，将分离毒株 WUH3株在Mare．145细胞上进行体外传代传75代，对WUH3株亲本株、第25代 (P25)、第50代(P50)、第75代(P75)进行全基因组测序，利用分子生物学各 种软件对不同代次细胞毒全基因组做生物信息学分析，研究WUH3株在体外传代过 程中传代毒株之间遗传进化规律，为高致病性PRRSV WUH3株不同代次细胞毒之 间氨基酸的变异和毒力的关系提供分子水平的依据，为研发高致病性PRRSV弱毒 疫苗提供理论和技术上的支持。主要研究内容包括： 1．高致病性PRRSV WUH3株的分离、鉴定 在“猪高热综合症发生时期利用Marc．145细胞对疑似发病猪的组织进行病毒 分离，并通过RT-PCR、间接免疫荧光等试验证实分离的病毒为PRRSV，命名为 PRRSVⅥm3株。 2．高致病性PRRSV WUH3株的体外传代 高致病性PRRSV WUH3株利用Marc．145细胞体外传代至75代，第5代细胞 毒接毒后3 d出现局灶性病变，5 d后出现70％细胞病变。随着传代次数不断增加， 出现细胞病变的时间不断缩短，由最初3 d缩短到75代的24 h，产生70％细胞病变 的时间由最初5 d缩短到第75代的49 h，TCID50殖总体呈上升趋势，毒量不断地增 高，这说明在体外传代过程中WUH3株适应细胞能力不断增强。 3．高致病性PRRSV WI册3株全基因组的序列分析 将高致病性PRRSV WUH3株及其传代细胞毒株P25，P50，P75做全基因序列 测定并进行分析。全基因组序列比对结果表明，PRRSV WUH3株及其传代细胞毒株 与国内现在流行的高致病性PRRSV具有相似的遗传标记，即Nsp2存在30个氨基 酸的不连续缺失以及5UTR和3UTR各缺失一个碱基。 与WUH3株亲本株相比，WUH3株传代细胞毒P75存在149个核苷酸突变，导 致了65个氨基酸发生有义突变。利用各种生物学软件对4代全基因组序列及氨基酸 做生物信息学分析，结果显示，很多氨基酸突变位于PRRSV基因组功能区。比如 信号肽序列(P4SoItF4)，跨膜区序列(L172FoRF4，P173AoRF4，S174IoRF4)，N一糖基化位 华中农业大学201 华中农业大学2011届硕士研究生学位论文 点序列(S133Nora：3)，有些抗原表位也发生了变化(AlsITNsr2)，这些氨基酸的突变 可能在病毒的复制，蛋白转运，信号转导中有一定作用。另外，PRRSVWUH3株传 代与JXAl株同步传代过程中有8个位点的突变方向相似，即E303I)NsP2，E296DNsP3， N162Sssp7，R204HNsPlo，F251SoRF2，L172FORF4，P173AoRF4，S174IORF4，推测这8个位点 在PRRSV传代过程中毒株毒力致弱有一定作用。 关键词：猪繁殖和呼吸综合征病毒；WUH3：传代；遗传变异 Ⅱ 高致病性PRRSV 高致病性PRRSV WUH3株分离鉴定及体外传代的遗传变异研究 Abs仃act Porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRS)is a serious infectious disease of swine，caused by porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)．It is characterized by severe reproductive failure in SOWS，and respiratory distress in growing pigs and piglets．In 1 987，it was first reported in the south of United States，PRRS has already been one of the most economically important diseases of the global swine industry． The‘‘high fever syndrom