分光光度法测定胆固醇含量.docVIP

实验八、分光亮度法测定胆固醇含量 一、实验目的 1、学习721分光亮度计的使用 2、掌握分光亮度法测定胆固醇含量的原理 3、学习并掌握利用分光亮度法制作胆固醇含量标准曲线的方法 二、实验原理 当一束平行的单色光照射到有色溶液时，光的一部分被溶液吸收，一部分透过溶液。假设入射光强度为I0，透过光强度为It，溶液的浓度为C，液层宽度为b，则 T＝ T＝－ I0 It （透光度或透光率） （朗伯－比尔定律的数学表达式） 式中：A为吸亮度，没有单位 K随C、b的单位而不同C：g/L,b:cm,k:L/g·cm,为吸光系数； C：mol/L,b:cm,k:L/mol·cm,为摩尔吸光系数 以上式子表明：当一束单色光通过有色溶液时，其吸亮度与溶液浓度及宽度成正比。当k、b都一定时，A与C成正比，因此若已知浓度溶液（即试样溶液）的吸光值As，在相同条件下测出未知浓度溶液的吸光值Ax，则试样溶液的浓度Cx可通过下式求出： （标准对照法，适用于非经常性的分析工作） 若是经常性的批量测定，则应用标准曲线法，即配制一系列已知浓度的标准溶液，在选定波长处，用同样的比色皿分别测其吸光值。作出“吸光值/含量”的标准曲线，在相同条件下测定未知浓度试样的吸光值，直接可从标准曲线上查出相应的浓度。 三、实验药品及仪器 药品:FeCl3·6H2O，磷酸(A.R.即“分析醇”)，浓硫酸（A.R.），胆固醇（C.P.），无水乙醇。 试剂：10％三氯化铁溶液：10gFeCl3·6H2O溶于磷酸，定容至100ml，存棕色瓶中，冷藏 磷硫铁试剂（P-S-Fe试剂）：取1.5ml10％三氯化铁溶液于100ml棕色容量瓶加 浓硫酸至刻度。 胆固醇标准溶液（0.08mg/ml）：称取80mg胆固醇溶于无水乙醇定容至100ml，配制成 10×的标准贮存液。 10×贮存液用无水乙醇稀释10倍，即为胆固醇标准溶液。 仪器：721分光亮度计，比色皿，试管，移液管 四、仪器使用（721分光亮度计） 1.接通仪器电源开关，打开比色皿暗箱盖，选择所需的单色光波长,预热20分钟； 2.将盛溶液的比色皿装入暗盒中（一般装空白溶液的比色皿放在第一格，装待测溶液的比色皿放在后面） 3.打开比色皿暗箱盖（光门自动关闭），调节“0”电位器，使电表指针指“0”（透光率为0），然后将盖子盖上（光电管受光），这时空白溶液的比色皿须正对于光路上，调节“100％”电位器，使电表指针指在“100”（透光率100%），若调不到100，可提高灵敏度。 4.连续几次调“0”和“100”后，就可以进行测定。测定时，将比色皿拉杆轻轻拉出一格，使第二个比色皿内的待测溶液进入光路，此时指针所指的读数就是该溶液的吸亮度。重复上述测定操作1-2次，读取相应的吸亮度值，取平均值。 5．实验完毕，切断电源，将比色皿取出洗净。 注意事项： 1.读数时，视线要正对着指针，表上两排数据不要读错，小数点也不要读错！ 2.放大器灵敏度有五档，“1”最低。其选择原则是保证能使空白档良好调到“100”情况 下，尽可能采用低灵敏度，这样仪器将有更高的稳定性。所以使用时一般置“1”，灵敏 度不够时再逐渐升高，但改变灵敏度后须重新调“0”和“100”。 3.拿比色皿时用手捏住毛玻璃两面，切不可触摸光面。每次使用完毕，应洗净，滤纸吸干， 不可用碱液和强氧化剂洗比色皿，避免腐蚀玻璃或使皿粘结处脱胶。 4.比色皿放入比色皿架前，须用擦镜纸吸干外壁的水珠。 五、实验内容 1、配制10％三氯化铁溶液、磷硫铁试剂、胆固醇标准溶液 2、打开721分光亮度计预热20分钟 3、取6根试管，编号1-6，各管分别加入0.08mg/ml胆固醇标准液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml，以无水乙醇补足至2.0ml，然后1-6管均各加入2.0ml磷硫铁试剂，摇匀。10分钟后分别转移到0.5cm光径的比色皿内，用721分光亮度计在560nm波长的单色光下，先用1号管的空白对照调“0”和“100”，然后同等条件下分别测定2-6管的吸光值A，记录数值。 4、算出各管胆固醇的实际浓度（单位：mg/ml）,然后以胆固醇浓度为横坐标，相应的吸光值为纵坐标，作标准曲线。 备注:各管胆固醇实际浓度C的计算公式 C实际=胆固醇标准液原浓度×移取的胆固醇标液体积V÷各管总体积 =0.08×V（胆固醇体积）÷4(单位为:mg/ml) 六、实验数据记录 管号 0.08mg/ml胆固醇标准液体积V（ml） 无水乙醇体积（ml） 磷硫铁试剂体积 （ml） 各管总体积(ml) 各管胆固醇实际浓度C实际(mg/ml) 各管 吸光值A 1 0 2.0 2.0 4.0 2 0.4 1.6 2.0 3 0.8 1.2 2.0 4 1.2 0.8 2.0 5 1.6 0.4 2.0 6 2.0 0 2.0 用坐标