薄层色谱法培训讲义.docVIP

PAGE PAGE 5 薄层色谱法 薄层色谱法是将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。 注意事项 样品的预处理。 样品及对照药材和供试品及对照药材溶液制备应量化操作，目的是使样品的色谱与对照药材的色谱更有可比性。 定量点样（除了鉴别有无，还可粗略进行量化评价） 在有条件的情况下，设化学对照品的同时设对照药材。 注意环境条件对样品色谱行为的影响。 一、薄层板 普通薄层板：硅胶G、H，硅胶GF254，聚酰胺薄膜等 市售薄层板 （商品预制板） 高效薄层板 自制薄层板：铺板用的匀浆不宜过稠或过稀：过稠，板容易出现拖动或停顿造成的层纹；过稀，水蒸发后，板表面较粗糙。匀浆配比一般是硅胶G:水=1：2～3，硅胶G:羧甲基纤维素钠:水=1:2。研磨匀浆的时间，根据经验来定，与空气湿度有关，一般通过拿起研棒时匀浆下滴的情况来判断，越稠越难下滴。匀浆的稀稠除影响板的平滑外，也影响板涂层的厚度，进一步影响上样量。涂层薄，点样易过载；涂层厚，显色不那么明显。 目前实验室使用的薄层板规格：10cm×10cm，10cm×20cm或20cm×20cm 注意事项 1、薄层板临用前一般应在110 2、聚酰胺薄膜不需活化。 3、如在存放期间被空气中杂质污染，使用前可用三氯甲烷、甲醇或二者的混合溶剂在展开缸中上行展开预洗，110℃ 4、使用前检查其均匀度，在反射光及透射光下检视，表面应均匀、平整、光滑、无麻点、无气泡、无破损及污染。 二、点样 1、点样器：专用毛细管、半自动或自动点样器械、薄层用微升注射器等。 2、点样： 10~15mmmm8~10mm810~15mmd≤3mm5~10mmd 10~15mmmm 8~10mm 810~15mm d≤3mm 5~10mm d≤2mm d 4~8mm ≥8mm ≥5 高效薄层板 普通薄层板 要求在洁净干燥的环境下点样。尽量用小的点样管。如果有足够的耐性，最好只用1微升的点样管。这样，点的斑点较小，展开的色谱图分离度好，颜色分明。样品溶液的含水量越小越好，样品溶液含水量大，点样斑点扩散大。样品溶液的溶剂一般是无水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。点好样的薄层板用电吹风的热风吹干或放入干燥器里晾干。 除另有规定外，用点样器点样于薄层板上，一般为圆点状或窄细的条带状。点样基线距底边10～15mm，高效板一般基线距底边8～10mm；圆点状直径一般不大于3mm，高效板一般不大于2mm；条带状宽度一般为5～10mm，高效板条带状宽度一般为4～8mm；点间距离可视斑点扩散情况以相邻斑点互不干扰为宜，一般为10～20mm（不少于8mm），高效板不少于5mm。 注意事项 1、薄层板上样品容积的负荷极为有限，普通薄层板的点样量最好在10ul以下，高效薄层板在5ul以下。点样量过多，可造成原点“超载”，展开剂产生绕行现象，使斑点拖尾。 2、供试品溶剂在原点的残留，也会改变展开的选择性。因此上样时同步干燥或上样后继后干燥以除去原点残存的溶剂是需要的，但应尽可能避免高温加热。 3、上样装置对薄层表面的机械损伤也影响色谱质量。点样时必须注意勿损伤薄层表面。 4、温湿度不同程度地影响色谱的质量。实验室一般要求相对湿度在65%以下为宜。如在空气中点样，一般以不超过10分钟为宜，以免吸附剂在空气中吸湿而降低活性。 5、展开剂所用的溶剂质量不好，也直接影响薄层色谱的分离能力。 三、展开 （一）展开剂配制????选择合适的量器把各组成溶剂移入分液漏斗，强烈振摇使混合液充分混匀，放置，如果分层，取用体积大的一层作为展开剂。绝对不应该把各组成溶液倒入展开缸，振摇展开缸来配制展开剂。混合不均匀和没有分液的展开剂，会造成层析的完全失败。各组成溶剂的比例准确度对不同的分析任务有不同的要求，尽量达到实验室仪器的最高精确度，比如：取1ml的溶剂，应使用1ml的单标移液管，移液管应符合计量认证要求，尽管多数时候这不是必须的。（二）展开系统的饱和????一般使用的是双槽的展开缸，一槽用来放展开剂，另一槽可加入氨水或硫酸。把待展开的板放入两槽间的平台，斜架着，盖上展开缸的盖子。让展开剂的蒸气充满展开缸，并使薄层板吸附蒸气达到饱和，防止边沿效应，饱和时间在半个小时左右。展开时难免要打开盖子把薄层板放入展开剂中，不过对薄层板与蒸气的吸附平衡影响不大，当然动作应该尽量轻、快。 （三）温湿度的控制????温湿度对薄层影响都很大。不冻结的前提下，通常温度越低分离越好，较难的分离需在低温下分离，例如人参皂苷。湿度的影响，主要是影响薄层板的吸附能力，导致选择性（容量因子）的变化，湿度应根据实际情况确定。温度控制使用空调器或冰柜，湿度控制