结核杆菌核酸扩增荧光检测.doc

结核杆菌核酸扩增荧光检测 目的：保证TB DNA检测结果准确、可靠。 适用范围：TB DNA的TaqMan荧光定量检测，标本类型为血清。 负责人：1 操作人：1 1 1 原理：本试剂盒用一对结核杆菌特异引物和一条结核杆菌特异性荧光探针，PCR反应液，耐热DNA聚合酶（Taq酶），四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，再用PCR体外扩增法检测结核杆菌DNA。 性能参数：检出低值＜1×103基因拷贝/ml。 标本要求： （1）标本类型：血清。 （2）标本采集：见标本采集手册。 （3）标本储存和运输：室温放置不超过8小时，4-8℃不超过72小时，-20℃保存期6个月，应避免反复冻融。室温运输。 （4）标本拒收状态：细菌污染、严重溶血或脂血标本不能作测定。 容器和添加剂类型：无菌离心管和无菌真空管。 所需设备：ABI GeneAmp 5700、台式高速离心机、混匀器、冰箱（4℃、-20℃）、生物安全柜、紫外灯 试剂：DNA提取液（500μl/管）2管；TB-PCR反应液（未贴标签管）20管；阳性定量质控标准品（1×108基因拷贝/ml）（50μl/管）1管；阴性质控品（250μl/管）1管。 校准程序（计量学溯源性）：送深圳市计量检测所校准。 程序步骤:： 11.1标本处理：标本采集、保存和运送 用无菌5ml玻璃管取受检者肺深部咳出痰液1~3ml，密闭，即为标本。或直接抽取外周血2ml（抗凝）。标本可立即用于测试，也可保存于-20℃待测，保存期为六个月。标本运送应采用0℃冰壶。 11.2标本及质控标准品的处理 痰液中加入4倍体积的4%NaOH室温放置10分钟后15000rpm离心5分钟。去上清，沉淀加无菌生理盐水1ml打匀，15000rpm离心5分钟；再重复洗涤一次。（知液标本直用淋巴细胞分离液分离沉淀）沉淀直接加50ulDNA提取液充分混匀,(提取液内含不溶于水的物质,取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头的现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截。)沸水浴10分钟（误差不超过1分钟），转至4℃静置6-8小时以保证充分裂解。10，000rpm离心5分钟，取上清液2ul做PCR反应。另取阴阳性质控标准品各40ul加等量DNA提取液打匀，沸水浴10分钟后同上处理。 11.3PCR扩增及DA-620仪器荧光检测操作 取单管人份PCR反应管一管，直接加入处理后样品或阴阳性质控品2ul，6000rpm离心数秒。将各反应管放入PCR仪，按下列条件扩增： 93℃ 2分钟预变性,然后按93℃45秒 55℃120秒,反应10个循环后置33℃保温,迅速逐个将反应管放入荧光检测仪,读取并记录读当数A0。荧光激发波长为487nm，检测波长为525nm。最后按93℃45秒 55℃120秒，共做30个循环后置33℃保温。使用PE9600，9700，2400仪器循环参数为93℃30秒 55℃60秒，其它仪器循环参数为93℃45秒 55℃120秒。 PCR反应后荧光检测，待各PCR管充分冷却至33℃后，迅速逐个将扩增后的反应管放入荧光检测仪，读取并记录读数A1。荧光激发波长为487nm，检测波长为525nm。 11.4 ABI GeneAmp5700操作 将各后应管放入PCR仪器的孔反应槽内，按对应顺序设置阴阳性质控标准品以及未知标本，并设置样品名称、标记荧光基团类和循环条件： ABI GeneAmp5700的循环条件：93℃ 2分钟预变性，然后按93℃45秒 55℃60秒，先做10个循环，最后93℃30秒 55℃45秒，做30个循环。 11.5结果分析条件的设定 ABI GeneAmp5700的条件设置：反应结束后保存检测数据文件。根据分析后图像调节baseline的start值(2~4),stop值(7~9)以及Threshold值,使阴性质控品Ct值为30,临界阳性质控标准品Ct值为22~24,强阳性质控标准品Ct值为18~20,最后记录仪器自动分析计算出的Ct值. 质量控制程序： 阴性质控品：全部阴性 阳性定量标准品：全部阳性 ︱r︱≧0.97(correlation 数值介于-0.97~-1); 108至104基因拷贝/ml的阳性标准品检测的定量值与理论值相比误差小于±300%。 干扰（如乳糜血、溶血、胆红素血）和交叉反应：乳糜血、溶血、胆红素血基本不影响本实验的测定。 生物参考区间：正常人样本为阴性或0基因拷贝/ml。 患者检验结果的可报告区间：Ct值40，实验样本的TB DNA含量（基因拷贝数/ml）=M；Ct值=40，样品 TB DNA含量1 ×103基因拷贝/ml。 警告/危急值（当适用时）： 实验室解释：为结核杆菌感染的辅助诊断以及治疗提供分子生物