沙眼衣原体核酸扩增荧光检测.doc

1医院检验科 PCR室作业指导书 文件编号：ABCD-3-PR-27 版本/修订号：A/0 主题内容 沙眼衣原体核酸扩增荧光检测 生效日期 第 PAGE 57 页 共 NUMPAGES 90 页 沙眼衣原体核酸扩增荧光检测 目的：保证CT DNA检测结果准确、可靠。 适用范围：CT DNA的TaqMan荧光定量检测，标本类型为分泌物。 负责人：1 操作人：1 1 1 原理：本试剂盒用一对沙眼衣原体特异引物和一条沙眼衣原体特异性荧光探针，PCR反应液，耐热DNA聚合酶（Taq酶），四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，再用PCR体外扩增法检测沙眼衣原体DNA。 性能参数：检出低值＜25基因拷贝/ml。 标本要求： （1）标本类型：分泌物。 （2）标本采集：见标本采集手册。 （3）标本储存和运输：室温放置不超过8小时，4-8℃不超过72小时，-20℃保存期6个月，应避免反复冻融。室温运输。 （4）标本拒收状态：细菌污染标本不能作测定。 容器和添加剂类型：无菌离心管和无菌试管。 所需设备：ABI GeneAmp 5700、台式高速离心机、混匀器、冰箱（4℃、-20℃）、生物安全柜、紫外灯 试剂：DNA提取液（500μl/管）2管；CT-PCR反应液（未贴标签管）20管；阳性定量质控标准品（1×108基因拷贝/ml）（50μl/管）1管；阴性质控品（250μl/管）1管。 校准程序（计量学溯源性）：送XXX市计量检测所校准。 程序步骤:： 11.1标本采集、保存和运送 男性：取尿道分泌物或细小棉拭子伸入快尿道约2~4cm，略捻拭子取出分泌物（应略带黏膜）。将分泌物或棉拭子置入无菌玻璃管，用无菌棉球将试管塞紧后，密闭送检。 女性：阴道—用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再用无菌棉拭子插入宫颈内，停5秒钟后旋动棉拭采取宫颈分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃管，用无菌棉球将试管塞紧后，密闭送检。 尿道—用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，再用无菌棉拭子插入尿道约2cm，略捻拭子取出分泌物（应略带黏膜）。将棉拭子置入无菌玻璃管，用无菌棉球将试管塞紧后，密闭送检。 标本可立即用于测试，也可保存于-20℃待测，保存期为6个月。标本运送应采用0℃冰壶。 11.2标本及对照标准品的处理 标本试管中加入1ml无菌生理盐水，充分震荡摇匀，吸取液体转至1.5ml离心管中（如分泌物较多，只取0.2ml）12000rpm离心5分钟.沉淀加无菌生理盐水1ml打匀,12000rpm离心5分钟,再重复洗涤一次.沉淀直接加50ulDNA提取液充分混匀, (提取液内含不溶于水的物质,取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头的现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截。) 沸水浴10分钟（误差不超过1分钟），转至4℃静置6-8小时以保证充分裂解。12，000rpm离心2分钟，取上清液2ul做PCR反应。另取阴阳性质控标准品各50ul加等量DNA提取液打匀，沸水浴10分钟后同上处理。 11.3GeneAmp5700操作 取单管单人份PCR反应管若干管，直接加入处理后样品（或阴阳性质控标准品）2ul，6000rpm离心数秒。将各反应管放入PCR仪，按下列条件扩增： ABI GeneAmp5700的循环条件：93℃ 2分钟预变性，然后按93℃45秒 55℃60秒，先做10个循环，最后93℃30秒 55℃45秒，做30个循环。所有设置全部完成后保存文件，最后运行程序。 11.4结果分析条件的设定 ABI GeneAmp5700的条件设置：反应结束后保存检测数据文件。根据分析后图像调节baseline的start值(2~4),stop值(7~9)以及Threshold值,使阴性质控品Ct值为30,临界阳性质控标准品Ct值为22~24, 强阳性质控标准品Ct值为18~20,最后记录仪器自动分析计算出的Ct值. 质量控制程序： 阴性质控品：全部阴性 阳性定量标准品：全部阳性 ︱r︱≧0.97(correlation 数值介于-0.97~-1); 108至104基因拷贝/ml的阳性标准品检测的定量值与理论值相比误差小于±300%。 干扰：标本污染。 生物参考区间：正常人样本为阴性或0基因拷贝/ml。 患者检验结果的可报告区间：Ct值40，实验样本的CT DNA含量（基因拷贝数/ml）=M；Ct值=40，样品 CT DNA含量25基因拷贝/ml。 警告/危急值（当适用时）： 实验室解释：为沙眼衣原体感染的辅助诊断以及治疗提供分子生物学上的参考依据。 其它：《沙眼衣原体核酸扩增荧光检测试剂盒说明书》见试剂盒