中国海洋大学基因工程L4第2章PCR技术.pptVIP

第二章 PCR技术 定义：在体外的无细胞体系中模拟天然DNA复制过程的使目的DNA的量增加的反应。 三、PCR反应成分 1、引物(Primer): 15-30nt 设计原则 *引物间 ---ACGC ---GAGC *引物内 --AACTGTT-- *GC% *末端保守性 *兼并碱基 2、 Taq酶 3、Mg2+ 4、模板(Template) 制备和用量 100bp~40kb 实际3~5k 难于得到长扩增产物的原因： *3’错配 *高温下脱嘌呤(depurination)或脱嘧啶(deamination)-Taq不能通过 pH7.0 100°C 1/100kb/min depu-pH6.45 1/20~30kb/min *反应添加剂、PCR循环参数、模板完整性 *Taq酶自动脱落 改进办法: *发展新酶（pfu、Vent双聚合酶-消除错配）or合成能力强酶(Tth) *Tricine（三羟甲基甘胺酸）-pH稳定性 5、PCR buffer Tris.Cl、KCl 6、dNTP 20-200?mol/L 四、平台效应： PCR 反应后期循环产物对数累积趋于饱和，伴随0.3~1pmol靶序列的增加。 *dNTP和引物快速掺入，浓度降低 *酶与模板比例下降 *变性温度高和温